發(fā)布時間：2017-12-06 17:30

  本文關(guān)鍵詞：小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的篩選及臨床應(yīng)用研究

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【摘要】：1研究背景與研究目的橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)是兒童軟組織肉瘤最常見的一個類型,腫瘤起源于能分化為橫紋肌的間充質(zhì)細胞,占小兒惡性腫瘤的3%-4%,占小兒軟組織肉瘤的55%-60%。且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。RMS瘤體生長迅速,一般無特異性的臨床表現(xiàn),沒有完整的真性包膜,容易形成局部浸潤或經(jīng)血流、淋巴管轉(zhuǎn)移,基于瘤體上述的特性,此腫瘤發(fā)現(xiàn)時多處于臨床II期以上,甚至有遠處的擴散或轉(zhuǎn)移,且術(shù)后復(fù)發(fā)率高,瘤體不易根治性切除,即使廣泛切除后,其復(fù)發(fā)率仍可高達39%。目前,橫紋肌肉瘤的早期診斷方法仍以彩色多普勒超聲、CT和MRI為主,切除程度的判斷及復(fù)發(fā)瘤的檢測仍缺乏特異性的方法,RMS早期根治性手術(shù)切除配合術(shù)后放化療等綜合治療,效果及預(yù)后基本令人滿意,但進入III期或IV期之后,RMS的生存率明顯降低,且復(fù)發(fā)率高�；赗MS的早期診斷、早期治療的重要性,臨床急需一個敏感度高、準(zhǔn)確性強的診斷和監(jiān)測的方法。進入21世紀(jì)以來,蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點,為腫瘤的早診斷、早治療提供很多新的方向,特別是不斷有新的、特異性強的腫瘤蛋白標(biāo)記物被鑒定出,大大提高了腫瘤診斷和治療水平。本課題組曾與中國科學(xué)院生物物理研究所、浙江大學(xué)腫瘤研究所聯(lián)合應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)成功的篩選并鑒定出多個惡性腫瘤的血清特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物,如腎母細胞瘤、胃癌、乳腺癌等,本課題組針對腎母細胞瘤做了系列研究,并取得一定研究成果。本實驗研究以課題組前期腎母細胞瘤篩選、鑒定及驗證技術(shù)路線為支撐,通過對橫紋肌肉瘤組及正常健康兒童組血清進行檢測及對比,篩選出特異性的蛋白質(zhì)標(biāo)記物,對不同分期患兒進行詳細分組,再次驗證并統(tǒng)計分析,初步建立分期診斷模型,結(jié)合隨訪及手術(shù)結(jié)果,將篩選出的蛋白質(zhì)標(biāo)記物應(yīng)用于復(fù)發(fā)瘤的預(yù)測及手術(shù)切除程度的判斷,最后通過定量分析并與臨床常用檢查方法對比,明確其臨床應(yīng)用的敏感性及特異性。2材料與方法2.1實驗材料2.1.1臨床病例資料本課題研究選取的血清樣本385例均來自河南省鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,采集時間2008年1月至2013年12月。分為:正常組、腫瘤組(I期,II期,III期,IV期)、復(fù)發(fā)組、瘢痕形成組、姑息性切除組、根治性切除組。該實驗橫紋肌肉瘤患兒病理診斷結(jié)果均為:胚胎性橫紋肌肉瘤(ERMS),所有病理樣本均經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)切除后取得,均送我院病理科按照統(tǒng)一的流程進行檢查,所有病理診斷結(jié)果均得到我院兩位以上的病理學(xué)專家的驗證。抽血取樣條件:晨起6點,所有橫紋肌肉瘤患兒及健康兒童均在空腹?fàn)顟B(tài)下抽血,留取外周靜脈血5ml,室溫靜置1小時,后轉(zhuǎn)至離心機處理,在4℃低溫環(huán)境下離心20分鐘,轉(zhuǎn)速:3000r/min,離心力:3000×g,抽取標(biāo)本的上清液,以每管100ul進行分裝,分裝完畢后放入低溫冰箱儲存,冰箱溫度條件:-80℃。本實驗均得到受試者監(jiān)護人的知情同意,并通過倫理委員會的批準(zhǔn)。2.1.2主要試劑及儀器主要試劑:尿素(Urea)、DTT(DL-Dithiothreitol,1,4-二硫代蘇糖醇)、IAM(Iodoacetamide,碘乙酰胺)、CHAPS(3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸)、SPA(sinapic acid,芥子酸)、TFA(Trifluoro-Acetic Acid,三氟乙酸)、超純水(HPLC grade)和乙腈(Acetonitrile,CAN)購自Sigma公司,產(chǎn)地:美國;Spectra Multicolor Low Range Protein Ladder購自Thermo公司,產(chǎn)地:美國;Trypsin購自Promega公司,產(chǎn)地:美國;Profiling Kit 100 MB-WCX購自Bruker Inc公司,產(chǎn)地:德國。主要儀器:Protein Chip、WCX2 Protein Chip、PBS II+SELDI-TOF-MS和Bio-processor購自Ciphergen Biosystems公司,產(chǎn)地:美國;MALDI-TOF-MS購自Bruker公司,產(chǎn)地:德國;High performance liquid chromatography購自Shimadzu公司,產(chǎn)地:日本;2D-LC-LTQ-MS購自Thermo Electron公司,產(chǎn)地:美國;ZUCIPDAS來自浙江大學(xué),產(chǎn)地:中國。2.2實驗方法2.2.1小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的篩選及臨床應(yīng)用的構(gòu)建已經(jīng)留取的血清樣本在冰浴中解凍30分鐘至60分鐘,完成解凍后使用4℃低溫離心機進行離心5分鐘,離心力為:12000×g,離心出來的上清液留取備用。5μL血清樣本、10μL MB-WCX Magnetic Beads、10μL MB-WCX Binding Buffer依次加入Eppendorf管中,充分振蕩,植入磁珠分離器中,后加入MB-WCX Wash Buffer 100μL,MB-WCX Elution Buffer 5μL加入裝有磁珠的Eppendorf管中,反復(fù)吹打,MB-WCX Stabilization Bu ffer 5μL加入待測管中,再次吹打,備用。芯片的預(yù)處理。添加稀釋液U9(1%DTT、9mol/L尿素、2%CHAPS),混合并搖勻,加入弱陽離子交換芯片的孔中,96個樣本可以通過弱陽離子交換芯片WCX2 Protein Chip一次性得到檢測,WCX2 Protein Chip插入Bio-processor工作支架中,仔細記錄芯片的坐標(biāo)情況。導(dǎo)入SELDI-TOF-MS儀器中進行檢測,對差異性血清蛋白質(zhì)進行篩選。整理并導(dǎo)出SELDI-TOF-MS實驗檢測數(shù)據(jù),去除無效數(shù)據(jù),分子質(zhì)量與相對表達量的標(biāo)準(zhǔn)要統(tǒng)一,完整提取各個樣本中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和相對表達量準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。SELDI-TOF-MS提取的數(shù)據(jù)經(jīng)過ZUCIPDAS技術(shù)分析(浙江大學(xué)),排除并嚴格處理技術(shù)上的干擾,挑選出m/z差異小于0.3%的數(shù)據(jù),并將其歸為一類。Wilcoxon秩和檢驗對初篩的數(shù)據(jù)進行進一步分析處理,得到不同組別的處理數(shù)據(jù),找出差異性蛋白質(zhì),通過SVM篩選處理,得到y(tǒng)ouden指數(shù)最高的組合模型,得出小兒橫紋肌肉瘤特異性血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物。統(tǒng)計學(xué)分析不同分期血清樣本的蛋白質(zhì)標(biāo)記物,得出相應(yīng)的表達強度數(shù)據(jù),同時進行生存分析,繪制ROX曲線,通過曲線下面積的計算,再經(jīng)過SVM篩選處理,得到y(tǒng)ouden指數(shù)最高的組合模型并得到分期診斷的臨界值。將復(fù)發(fā)組、瘢痕殘留組、不同手術(shù)切除程度組患兒血清樣本中差異性表達的蛋白質(zhì)標(biāo)記物進行統(tǒng)計學(xué)分析,得出不同組別患兒蛋白質(zhì)標(biāo)記物的表達強度,同時進行生存分析,得到復(fù)發(fā)瘤表達強度的臨界值。2.2.2小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的純化與鑒定選取目標(biāo)蛋白質(zhì)表達量較高的腫瘤組血清樣本,根據(jù)SELDI-TOF-MS篩選結(jié)果,應(yīng)用HPLC分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)樣品。解凍冰箱取出的血清。600μl ACN和300μl超純水加入100μl血清樣本中,吹打、離心,SPD SpeedVac真空冷卻離心濃縮系統(tǒng)將上清液凍干,高效液相色譜儀中沖洗C18色譜柱分離純化上述血清樣品,EP管收集對應(yīng)于HPLC圖上峰值中的蛋白質(zhì),使用MALDI-TOF-MS對蛋白質(zhì)樣品進行質(zhì)荷比的檢測,找出質(zhì)荷比與7636Da相近的的蛋白質(zhì)所在的樣本(大約存在0.03%的誤差)。酶解目標(biāo)蛋白質(zhì)。應(yīng)用2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)進行檢測。應(yīng)用SEQUEST程序檢索目標(biāo)蛋白質(zhì)標(biāo)記物,導(dǎo)入Bioworks數(shù)據(jù)庫,檢索出與目標(biāo)肽段匹配的蛋白質(zhì)。2.2.3小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的驗證及敏感性、特異性對比ELISA方法對目標(biāo)蛋白質(zhì)(MIF)進行定量分析。配備MIF凍干標(biāo)準(zhǔn)品,濃度每2倍遞增。加樣器校準(zhǔn)后,取100μl各濃度樣本,吸頭垂直滴加入96孔板,抗MIF抗體提前預(yù)包被,同時設(shè)置3個復(fù)孔。每組各取10個血清樣本,取100μl各濃度樣本,吸頭垂直滴加入96孔板,板塊整個用封板模封閉,溫箱控制嚴格按照說明書,酶標(biāo)板孵育。各孔液體吸去后,抗人MIF抗體用生物素標(biāo)記,取100μl加入孔內(nèi),再次酶標(biāo)板孵育;孔板用自來水和清洗劑注滿,玻璃板、電泳槽及相關(guān)附件予以清洗,在吸水紙上拍干孔內(nèi)的液體,后使用通風(fēng)櫥,自然狀態(tài)下晾干�？装甯骺壮浞至栏珊蠹尤階BC工作液,酶標(biāo)板孵育;超純水再次洗板,自然狀態(tài)下晾干,90μl TMB顯色液加入每孔中,酶標(biāo)板孵育后各加入100μl TMB終止液。ELISA方法對目標(biāo)蛋白質(zhì)(MIF)進行定量分析的結(jié)果與臨床常用診斷方法進行對比,以病理學(xué)檢查結(jié)果作為判斷的金標(biāo)準(zhǔn),以驗證MIF診斷模型的敏感性及特異性。3結(jié)果3.1小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白標(biāo)記物的篩選標(biāo)準(zhǔn)化處理并分析腫瘤組和正常組質(zhì)譜數(shù)據(jù),提取蛋白質(zhì)表達的峰值數(shù)據(jù)及蛋白質(zhì)分解的肽段峰值數(shù)據(jù)信息。Wilcoxon秩和檢驗對蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)進行處理(P0.01),通過數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計,得到蛋白質(zhì)各自表達的m/z及其峰值;對比兩種數(shù)據(jù)并進行t檢驗(α=0.01),針對上述兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析得出:橫紋肌肉瘤患兒血清高表達的蛋白質(zhì)峰值有6個,橫紋肌肉瘤患兒血清低表達的蛋白質(zhì)峰值有1個,導(dǎo)入SVM程序進行數(shù)據(jù)處理,得到y(tǒng)ouden指數(shù)最高的組合模型,得出m/z 7636Da的目標(biāo)蛋白標(biāo)記物。該標(biāo)記物在正常組中低表達,表達強度為298.30±216.36;在腫瘤組中高表達,表達強度為2108.40±897.83。兩組進行比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。3.2小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物M/Z 7636Da對腫瘤分期的判斷應(yīng)用上述篩選技術(shù)對RMS不同分期M/Z 7636Da的表達強度進行對比分析,結(jié)果提示:RMS-I期組、RMS II期組、RMS-III期組和RMS-IV期組中的m/z7636Da蛋白質(zhì)的表達強度分別為923.95±361.88、1854.75±322.97、2567.95±412.15、3086.96±414.47。同時對正常組、RMS-I期組、RMS II期組、RMS-III期組和RMS-IV期組分別進行統(tǒng)計學(xué)分析,任意兩組數(shù)據(jù)之間差異均有統(tǒng)計學(xué)差異,P0.01。M/Z 7636Da表達水平生存分析統(tǒng)計結(jié)果示:正常組,M/Z 7636Da表達量423.5000;RMS-I期組,423.5000M/Z 7636Da表達量1424.0000;RMS II期組,1424.0000M/Z 7636Da表達量2311.5000;RMS-III期組,2311.5000M/Z 7636Da表達量2819.0000;RMS-IV期組,M/Z 7636Da表達量2819.0000。3.3小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物M/Z 7636Da對復(fù)發(fā)瘤預(yù)測及判斷對m/z 7636Da蛋白質(zhì)標(biāo)記物在正常組、術(shù)前組、復(fù)發(fā)組、術(shù)后瘢痕形成組中的差異進行對比分析,表達強度如下:正常組為298.30±216.36、術(shù)前組為1875.00±962.61、復(fù)發(fā)組為2209.35±786.17、瘢痕形成組為440.35±401.19。m/z 7636Da蛋白標(biāo)記物在術(shù)后復(fù)發(fā)組的表達與術(shù)前組對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與正常組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);m/z 7636Da蛋白標(biāo)記物在術(shù)后瘢痕形成組的表達與正常組對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與術(shù)前組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。術(shù)后M/Z 7636Da表達水平生存分析統(tǒng)計結(jié)果示:M/Z 7636Da表達量1135.0000提示術(shù)后復(fù)發(fā)。3.4小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物M/Z 7636Da對微創(chuàng)手術(shù)切除程度判斷對m/z 7636Da蛋白質(zhì)標(biāo)記物在不同微創(chuàng)手術(shù)切除程度組中的差異進行對比分析,表達強度如下:正常組為298.30±216.36、術(shù)前組為1875.00±962.61、姑息性切除組為1756.70±695.01、根治性切除組為476.70±324.75;m/z7636Da蛋白標(biāo)記物在姑息性切除組的表達與術(shù)前組對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與正常組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);m/z 7636Da蛋白標(biāo)記物在根治性切除組的表達與正常組對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與術(shù)前組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.5小兒橫紋肌肉瘤血清標(biāo)記物的純化及鑒定應(yīng)用HPLC分離純化樣本中目標(biāo)蛋白質(zhì),EP管收集對應(yīng)于HPLC圖上峰值中的蛋白質(zhì),進行MALDI-TOF-MS檢測,找出質(zhì)荷比為7636Da蛋白質(zhì)或肽段樣品。酶解質(zhì)荷比為7636Da的蛋白質(zhì)或肽段,置入2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)檢測,獲得PMFs,進一步檢測分析獲得酶解蛋白質(zhì)片段氨基酸序列,導(dǎo)入SEQUEST程序中,應(yīng)用Bioworks數(shù)據(jù)庫檢索,匹配并獲得完整的氨基酸序列圖,結(jié)果提示質(zhì)荷比為7636Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為:RASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHVVPDQLMAFGGSSEPCALC SLHSIGKIGGAQNRSYSKLLCGLL;此肽段為MIF(Macrophage migration inhibitory factor)。3.6小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的驗證本階段實驗用ELISA方法檢測小兒橫紋肌肉瘤不同分期MIF的含量,經(jīng)過統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析,結(jié)果提示隨著分期的上升,MIF的含量依次升高,正常組、I期、II期、III期、IV期中MIF的表達量分別為692.18±221.43、1018.27±246.54、1293.73±225.22、2381.82±408.19、2790.09±321.12,各分期與正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。本階段實驗應(yīng)用ELISA方法對正常組、術(shù)前組、姑息性手術(shù)切除組、根治性手術(shù)切除組MIF的表達量進行定量分析,表達量分別為692.18±221.43、2133.79±809.22、2833.91±769.41、1499.09±588.76,姑息性手術(shù)切除組與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),根治性手術(shù)切除組與術(shù)前組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。本階段實驗應(yīng)用ELISA方法對正常組、術(shù)前組、復(fù)發(fā)組、術(shù)后瘢痕形成組MIF的表達量進行定量分析,表達量分別為692.18±221.43、2133.79±809.22、2740.46±415.09、1284.18±348.34,復(fù)發(fā)組與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),術(shù)后瘢痕形成組與術(shù)前組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.7小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的敏感性、特異性驗證本階段實驗以ELISA方法對樣本進行MIF定量分析,以該結(jié)果為臨床診斷模型,與臨床常用的輔助檢查手段進行對比,如:64層CT平掃+增強、3.0MRI,以病理學(xué)檢查結(jié)果作為判斷的金標(biāo)準(zhǔn),以驗證MIF診斷模型的敏感性及特異性,該部分實驗對象均為盲選患兒,與正常健康兒童比較,MIF診斷模型的敏感性為97.9%,特異性100%,與常見小兒腹部實體腫瘤比較,MIF診斷模型的敏感性為97.9%,特異性87.5%。4結(jié)論4.1.目標(biāo)蛋白質(zhì)m/z 7636Da可以作為小兒橫紋肌肉瘤的特異性血清生物學(xué)標(biāo)記物,對臨床懷疑橫紋肌肉瘤,可以對該蛋白質(zhì)標(biāo)記物進行檢測。4.2.目標(biāo)蛋白質(zhì)m/z 7636Da可以作為小兒橫紋肌肉瘤的分期診斷的血清生物學(xué)標(biāo)記物,對復(fù)發(fā)瘤的預(yù)警及手術(shù)切除程度的判斷有重要的指導(dǎo)意義。4.3.通過對目標(biāo)蛋白質(zhì)或肽段的統(tǒng)計分析及鑒定,質(zhì)荷比為7636Da的蛋白質(zhì)或肽段初步確定為MIF。4.4.MIF在小兒橫紋肌肉瘤早期診斷的敏感性較其它常用影像學(xué)診斷方法具有明顯的優(yōu)勢。4.5.MIF在小兒橫紋肌肉瘤與常見小兒腹部實體腫瘤鑒別的特異性較好,提示MIF可能還存在于其他小兒實體腫瘤中。后期研究中,須進一步擴大樣本量,與其他腫瘤進行對比,以明確其特異性,及在不同類型RMS的表達情況。同時,進一步探索MIF與RMS發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系,從而明確MIF在RMS發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R738.7

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10 宋羽;陳小燕;李巧珍;;轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad信號在橫紋肌肉瘤中的表達意義[A];2013醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十三屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2013年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 衣曉峰 李媛媛;復(fù)發(fā)橫紋肌肉瘤能綜合治療[N];健康報;2004年

2 衣曉峰；李媛媛;復(fù)發(fā)橫紋肌肉瘤綜合治療新方法[N];中國醫(yī)藥報;2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 崔西春;小兒橫紋肌肉瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的篩選及臨床應(yīng)用研究[D];鄭州大學(xué);2017年

2 高松源;生肌調(diào)節(jié)因子在橫紋肌肉瘤中的表達與DNA倍體、融合基因的相關(guān)性研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

3 王守立;TGF-β1反義寡核苷酸對人橫紋肌肉瘤細胞生長分化的影響[D];四川大學(xué);2004年

4 徐玉生;TRAIL與順鉑協(xié)同誘導(dǎo)橫紋肌肉瘤細胞凋亡的實驗研究[D];浙江大學(xué);2005年

5 劉君;miR-214在骨骼肌發(fā)育與分化以及橫紋肌肉瘤發(fā)生過程中的作用和機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王媛媛;GLI1和MDM2蛋白在橫紋肌肉瘤中的表達及意義[D];石河子大學(xué);2015年

2 鄧立維;體部橫紋肌肉瘤的臨床特征與CT表現(xiàn)[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

3 彭吉風(fēng);上皮—間葉轉(zhuǎn)化相關(guān)因子在橫紋肌肉瘤中的表達及意義[D];石河子大學(xué);2016年

4 王正;橫紋肌肉瘤中小窩蛋白-3的表達及意義[D];南京醫(yī)科大學(xué);2008年

5 李巧新;比較基因組雜交技術(shù)分析橫紋肌肉瘤中染色體基因組的變化及意義[D];石河子大學(xué);2008年

6 吳祥;鼻腔橫紋肌肉瘤4例并文獻復(fù)習(xí)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

7 李濤;熱放療對人橫紋肌肉瘤RD細胞作用的實驗研究[D];浙江大學(xué);2007年

8 孫超;GEFT蛋白在橫紋肌肉瘤中的表達及預(yù)后意義[D];石河子大學(xué);2014年

9 李曉營;運用MassArray技術(shù)檢測橫紋肌肉瘤中的基因突變[D];石河子大學(xué);2013年

10 李揚;橫紋肌肉瘤中HMGA1和HMGA2的表達及其臨床意義[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：1259430