發(fā)布時間：2017-12-06 07:09

  本文關鍵詞：埃博拉病毒VP35與抑制劑、碳納米管和dsRNA作用模式及機理的分子動力學模擬研究

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【摘要】：埃博拉病毒(EBOVs)通常會引起嚴重的出血熱癥狀,如果不進行有效的治療一般會有很高的致死率,到目前為止還沒有有效的治療手段。具有多種功能的埃博拉病毒蛋白VP35在病毒的轉錄復制和對人體的免疫逃逸中起著至關重要的作用,因此VP35被認為是藥物設計和開發(fā)的潛在靶點。但傳統(tǒng)的實驗手段對埃博拉病毒VP35與配體以及其免疫逃逸機制的微觀機理的研究具有一定的局限性。本文利用分子動力學(MD)模擬的方法對VP35干擾素抑制域(VP35ⅡD)與潛在的小分子抑制劑吡咯烷酮類化合物GA017、碳納米管和dsRNA的結合模式以及作用機理進行了研究。(1)VP35 ⅡD與GA017結合模式及作用機理的分子動力學模擬研究VP35ⅡD第一功能區(qū)(FBP)可以與埃博拉病毒核蛋白結合,在病毒的轉錄復制中起著重要的作用。在這項研究中,我們用全原子分子動力學模擬的方法以及MM/GBSA能量分解的方法對野生型(WT),單突變型(K248A,K251A和I295A)和雙突變型(K248A/I295A)與GA017的結合模式及作用機理進行了研究。模擬結果表明與GA017的結合使VP35 ⅡD的結構更加穩(wěn)定,同時使VP35第一功能區(qū)(FBP)的口袋空間減小。計算結果還說明了靜電相互作用和范德華相互作用在VP35與GA017結合過程中起著主要作用。I295A單突變和K248A/I295A雙突變對VP35第一功能區(qū)的結構具有很大的影響,1295A的突變致使氨基酸R300-G301-D302形成一個新的螺旋,而K248A/I295A雙突變導致氨基酸V294-I295-H296-I297形成的折疊消失。此外,結合能的計算表明I295A和K248A/I295A突變致使與GA017的結合能降低,而K248A和K251A突變使結合能有所升高。我們得到的研究結果與實驗結果具有較好的一致性,K248A/I295A雙突變基本上會導致VP35與小分子結合失敗。這里的實驗結果對日后進一步設計對抗埃博拉病毒的小分子抑制劑具有一定的指導意義。(2)碳納米管與VP35 ⅡD結合模式及作用機理的分子對接及分子動力學模擬研究碳納米管具有很多相對于其他材料非常獨特的性質,引起了人們對其大量的研究,并且應經(jīng)成功應用于很多領域。同時,納米管也被發(fā)現(xiàn)在藥物輸運和作為抑制劑方面具有巨大的研究價值。本文利用分子對接的方法研究了不同長度不同直徑的單壁碳納米管(SWCNT)與VP35 ⅡD的對接,然后從中選取22個構象進行全原子分子動力學模擬,來研究不同尺寸納米管對蛋白結構的影響以及納米管的最佳結合構象,之后用全原子分子動力學模擬和MM/GBSA自由能計算的方法研究了 SWCNT與WT和突變型(K248A、I295A和K248A/I295A)之間的結合模式和作用機理。分子對接和分子動力學模擬結果表明隨著納米管長度和直徑的增大,對蛋白質結構的穩(wěn)定性也產生了較大的影響,像VS7-a體系中,碳納米管插入到蛋白質的二級結構中,對蛋白的空間結構產生了嚴重的破壞,再如VS10-b體系中碳納米管的作用致使殘基305-309形成的α螺旋與殘基238-252形成的αα螺旋遠離,使得蛋白整體結構變得松散不穩(wěn)定。通過對各個體系結合自由能的分析,我們發(fā)現(xiàn)隨著碳納米管長度的增長結合自由能也隨之增加,但是當納米管長度增加到一定長度后,結合能基本上就不再增加了,而碳納米管直徑的變化不會對結合能產生太大的影響,但會對蛋白結構穩(wěn)定性產生不利影響。相對于 WT-SWCNT 體系,突變體系 K248A-SWCNT、I295A-SWCNT 和 K248A/I295A-SWCNT的結合自由能都有所降低,但是并不太顯著。說明關鍵殘基突變在一定程度上會影響到SWCNT與VP35 ⅡD的結合,但是影響并不太明顯。此外,SWCNT在與VP35 ⅡD結合過程中,范德華相互作用起著決定性的作用。該研究結果可以為納米管對蛋白毒性的研究提供理論上的參考。(3)VP35 ⅡD與dsRNA的相互作用及識別機制的分子動力學模擬研究VP35ⅡD中央功能區(qū)(CBP)可以識別并競爭性結合可以激活人體對病毒免疫反應的雙鏈RNA(dsRNA)骨架和末端,從而實現(xiàn)病毒對人體的免疫逃逸。選擇性突變VP35 ⅡD CBP保守殘基可以使VP35 ⅡD喪失對dsRNA結合活性,從而削弱EBOV以VP35ⅡD為基礎的干擾素抑制。在這里,我們用全原子分子動力學模擬和結合自由能分析的方法并結合對VP35 ⅡDCBP的保守氨基酸進行突變來研究VP35 ⅡD CBP與dsRNA的微觀作用機理,以期找出廢除VP35 ⅡD能識別和結合dsRNA的關鍵點。通過對達到平衡后的VP35ⅡD與dsRNA復合物結構進行分析,我們發(fā)現(xiàn)殘基R312A/R322A雙突變會導致dsRNA與VP35 ⅡD的結合位點以及取向與WT-dsRNA完全不同,也就是說R312A/R322A雙突變會導致VP35 ⅡD失去結合dsRNA的功能。結合自由能的計算表明殘基R312A,R322A和K339A單突變會使VP35 ⅡD與dsRNA的結合自由能分別降低17.82,13.18和13.68kcal/mol。自由能分解表明關鍵殘基較大的結合能貢獻主要來源于較強的靜電相互作用,分析得出這主要是因為關鍵殘基(R312,R322和K339)帶有正電的側鏈與帶有負電的dsRNA骨架相互作用導致。R312A,R322A和K339A單突變雖然對VP35 ⅡDCBP的結構沒有太大的影響,但是這些殘基的突變破壞了體系氫鍵網(wǎng)絡和CBP表面靜電勢的分布,從而很大程度上改變了 R312,R322等殘基對結合自由能的靜電相互作用的貢獻。模擬結果表明VP35ⅡDCBP端帽氨基酸主要作用是識別dsRNA末端,其與dsRNA的作用主要是范德華相互作用,而CBP內的關鍵保守殘基R312,R322和K339可以通過其側鏈與dsRNA骨架較強的靜電相互作用使得dsRNA固定于CBP中,在dsRNA結合中起著至關重要的作用。
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R373;TB383.1

【參考文獻】

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1 ;Inhibition of M-MuLV reverse transcriptase activity by fullerene derivatives[J];Chinese Science Bulletin;2006年20期

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本文編號：1257749