本文關(guān)鍵詞：組蛋白甲基化修飾在維甲酸致神經(jīng)管畸形發(fā)生中的作用及分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 神經(jīng)管畸形 轉(zhuǎn)錄組譜 H3K27me3 Hox基因 Nr2e1基因

【摘要】：目的:神經(jīng)管畸形(Neural tube defects,NTDs)是由神經(jīng)管閉合障礙引起的一種常見的先天性出生缺陷疾病,嚴(yán)重影響了人口質(zhì)量,但其病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚不清楚,因此,深入研究NTDs的發(fā)病機(jī)制對(duì)于降低出生缺陷、提高人口質(zhì)量意義重大。本研究的目的主要有:1揭示維甲酸(Retinoic acid,RA)誘導(dǎo)的NTDs鼠胚的轉(zhuǎn)錄組譜變化,篩選出NTDs相關(guān)的重要差異表達(dá)基因。2重點(diǎn)研究Hox基因在NTDs中的變化規(guī)律,探討組蛋白H3K27me3甲基化修飾對(duì)Hox基因的調(diào)控作用,從表觀遺傳角度闡釋環(huán)境因素影響NTDs發(fā)生的機(jī)制。另外,初步探討Nr2e1基因在RA誘導(dǎo)的NTDs發(fā)生中的作用及機(jī)制。方法:1采用RNA-seq技術(shù)測定NTDs鼠胚轉(zhuǎn)錄組譜變化。1.1采用28mg/kg RA于小鼠胚胎7.5天(E7.5d)時(shí)對(duì)孕鼠進(jìn)行灌胃構(gòu)建NTDs鼠胚模型,對(duì)照組孕鼠采用同等劑量香油進(jìn)行灌胃,分別于E8.5d、E9.5d和E10.5d分離鼠胚腦泡組織,采用Illumina HiSeqTM 2000測序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組譜的測定。1.2采用RPKM法計(jì)算基因表達(dá)量,將FDR≤0.001且Log2Ratio≥1的基因定義為差異表達(dá)基因,并進(jìn)行GO和KEGG pathway顯著性富集分析,了解差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程及信號(hào)代謝通路。1.3通過取交集的方法篩選出在E8.5d、E9.5d和E10.5d均為差異表達(dá)的基因,即與NTDs相關(guān)的差異表達(dá)基因,并通過RT-PCR和RT-qPCR對(duì)篩選基因進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證。2rna-seq測序數(shù)據(jù)中hox基因呈現(xiàn)整體上調(diào),本研究將重點(diǎn)圍繞顯著差異表達(dá)的hox基因進(jìn)行深入探討。2.1采用rt-qpcr檢測ra干預(yù)的ntds鼠胚腦泡組織及sv/129小鼠胚胎干細(xì)胞(escs)和c57bl/6鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞(nscs)中的hox基因mrna水平。2.2采用westernblot檢測ra干預(yù)的ntds鼠胚腦泡組織及escs和nscs中的h3k27me3修飾水平。2.3采用rt-qpcr檢測ra干預(yù)的ntds鼠胚腦泡組織及escs和nscs中的h3k27me3甲基化轉(zhuǎn)移酶ezh2和去甲基化酶kdm6a和kdm6b的mrna水平。2.4采用chip-qpcr檢測ra干預(yù)的escs中h3k27me3在hox基因啟動(dòng)子區(qū)的富集情況。2.5采用nanostring技術(shù)檢測臨床ntds標(biāo)本中hox基因的表達(dá)情況,采用westernblot檢測h3k27me3修飾水平。3對(duì)rna-seq數(shù)據(jù)中表達(dá)豐度最高、差異倍數(shù)最大的下調(diào)差異表達(dá)基因nr2e1的作用和機(jī)制進(jìn)行初步探討。3.1采用全胚胎原位雜交和rt-pcr技術(shù)對(duì)ra誘導(dǎo)的ntds鼠胚nr2e1基因時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行檢測。3.2通過集落形成、cck-8、流式細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光等方法比較正常組和ntds組分離出的兩種nscs的增殖和分化能力,并采用rt-pcr和westernblot技術(shù)檢測nr2e1基因在兩種nscs中的表達(dá)情況。3.3采用慢病毒作為nr2e1shrna的載體轉(zhuǎn)染正常組nscs,通過集落形成計(jì)數(shù)和cck-8法檢測nr2e1基因?qū)scs增殖的影響,通過免疫熒光法計(jì)數(shù)map2和gfap陽性細(xì)胞,檢測nr2e1基因?qū)scs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響。結(jié)果:1ntds鼠胚轉(zhuǎn)錄組譜的變化情況。1.1brc8_5-vs-bra8_5檢測到587個(gè)差異表達(dá)基因,上調(diào)296個(gè),下調(diào)291個(gè);brc9_5-vs-bra9_5檢測到2256個(gè)差異表達(dá)基因,上調(diào)1782個(gè),下調(diào)474個(gè);brc10_5-vs-bra10_5檢測到2337個(gè)差異表達(dá)基因,上調(diào)1464個(gè),下調(diào)873個(gè)。1.2經(jīng)過go功能性富集分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要與軸突、細(xì)胞連接、細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞成分相關(guān),與結(jié)合能力、通道活性及轉(zhuǎn)運(yùn)能力等分子功能相關(guān),與組織器官發(fā)育過程、細(xì)胞發(fā)育、分化和遷移等生物學(xué)過程相關(guān),但各時(shí)期差異表達(dá)基因富集的goterms略有不同。1.3經(jīng)過keggpathway富集分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與軸突導(dǎo)向、基底細(xì)胞癌、細(xì)胞粘附分子、膽堿能突觸、hedgehog信號(hào)通路、糖酵解/糖異生等pathway。1.4通過取交集的方法,篩選到了196個(gè)在3個(gè)時(shí)期均有差異表達(dá)的基因,根據(jù)基因表達(dá)模式大致分為2類,以上調(diào)為主的基因和以下調(diào)為主的基因。其中,上調(diào)基因主要參與識(shí)別、細(xì)胞分化和前/后軸模式特異化等生物學(xué)過程,而下調(diào)基因主要參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)發(fā)育、神經(jīng)元分化、神經(jīng)元產(chǎn)生、神經(jīng)發(fā)生等生物學(xué)過程。1.5將差異倍數(shù)增加至20倍,篩選出了26個(gè)在ntds發(fā)生過程中呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)的基因,其中25個(gè)基因得到了rt-qpcr驗(yàn)證。2hox基因的h3k27me3調(diào)控通路在ntds發(fā)生中的作用。2.1在前期rna-seq測序數(shù)據(jù)中,篩選了10個(gè)差異倍數(shù)大于20倍的hox基因,其在ntds發(fā)生過程中較正常組鼠胚均呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào),并且這種變化趨勢在ra干預(yù)的sv/129鼠escs和c57bl/6鼠nscs中得到了驗(yàn)證。2.2ra干預(yù)的escs和nscs中及鼠胚腦泡組織中均顯示h3k27me3水平顯著下降,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)h3k27me3修飾水平降低是由甲基化轉(zhuǎn)移酶ezh2表達(dá)降低而去甲基化酶kdm6b表達(dá)升高引起。2.3chip-qpcr結(jié)果顯示,在ra干預(yù)下h3k27me3與10個(gè)hox基因的結(jié)合能力均減弱,即h3k27me3修飾水平發(fā)生降低,引起了下游hox基因的表達(dá)上調(diào)。2.4臨床無腦畸形樣本中的hox基因呈現(xiàn)整體上調(diào),并且h3k27me3修飾水平發(fā)生下降,其中hoxc4和hoxd1表達(dá)與h3k27me3修飾水平呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性。3nr2e1在ra誘導(dǎo)的ntds發(fā)生中的作用。3.1全胚胎原位雜交結(jié)果顯示,nr2e1主要表達(dá)在鼠胚前腦,正常發(fā)育過程中表達(dá)逐漸增高,而在ntds鼠胚中幾乎沒有變化;rt-pcr結(jié)果也顯示nr2e1在ntds胚胎中的表達(dá)顯著低于正常組。3.2集落計(jì)數(shù)和CCK-8結(jié)果顯示正常組NSCs的增殖能力顯著高于NTDs組NSCs;FCM結(jié)果表明NTDs組NSCs的細(xì)胞被捕獲在了G1期,無法進(jìn)入S期(即DNA合成期);免疫熒光結(jié)果表明NTDs組NSCs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力都顯著低于正常組,說明NTDs組的NSCs是受損的細(xì)胞。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,Nr2e1在NTDs組NSCs中表達(dá)顯著低于正常組NSCs。3.3 LV3-Nr2e1 shRNA轉(zhuǎn)染NSCs,結(jié)果表明抑制Nr2e1表達(dá)顯著降低了NSCs的增殖能力,并且使NSCs向神經(jīng)元分化能力減弱,而向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化能力增強(qiáng),即NSCs分化發(fā)生紊亂。結(jié)論:1 RA誘導(dǎo)的NTDs鼠胚轉(zhuǎn)錄組譜發(fā)生了顯著變化,篩選出25個(gè)與NTDs相關(guān)的顯著差異表達(dá)基因,其中10個(gè)Hox基因發(fā)生上調(diào),Nr2e1基因表達(dá)豐度最高且下調(diào)倍數(shù)最明顯。2 Hox基因在NTDs鼠胚中呈現(xiàn)整體表達(dá)上調(diào)趨勢,其表達(dá)紊亂受到了H3K27me3的調(diào)控,并且這種Hox基因的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在臨床無腦畸形的發(fā)生中具有重要作用,從組蛋白甲基化修飾角度為NTDs的發(fā)生提供新的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。3 Nr2e1基因表達(dá)下調(diào),可引起NSCs增殖和分化障礙,參與RA誘導(dǎo)的NTDs發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R748

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本文編號(hào)：1257904