本文關鍵詞：CHAF1A基因在非小細胞肺癌細胞中的功能和分子機制研究

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【摘要】：研究目的:1.檢測CHAF1A在非小細胞肺癌(NSCLC)組織及癌旁組織中的表達情況,闡明CHAF1A在非小細胞肺癌中的表達;并研究CHAF1A與部分臨床參數(shù)的關系;2.檢測CHAF1A基因在人肺癌細胞株A549、H1299和H1975中的表達;應用siRNA干擾技術進行慢病毒包裝并感染目的細胞,敲減CHAF1A基因,干擾CHAF1A基因表達,觀察細胞的生長、增殖及凋亡;3.探討CHAF1A基因敲減后非小細胞肺癌細胞周期的變化;4.檢測敲減CHAF1A基因后,非小細胞肺癌細胞下游靶基因表達的變化。探尋具有非小細胞肺癌生長、增殖、轉移潛能的預測性生物標志物及其作用機制,為肺癌的診治探索新的思路。研究方法:1.收集2010年12月至2016年1月在山西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院胸外科行手術切除,并且全部經(jīng)過病理診斷證實為非小細胞肺癌(NSCLC)的患者218例,行免疫組化、免熒光PCR檢測,闡明CHAF1A在非小細胞肺癌中的表達;分析CHAF1A與部分臨床參數(shù)的關系;2.將包裝含有CHAF1A基因RNA干擾靶點序列及空載對照慢病毒分別感染H1299細胞,采用倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況,觀察病毒感染率;Realtime PCR法檢測肺癌細胞系H1299細胞CHAF1A的表達變化;3.MTT法、Cellomics細胞計數(shù)及細胞克隆形成試驗,檢測敲減CHAF1A基因后,肺癌H1299細胞的增殖;4.CHAF1A基因敲減后,采用流式細胞技術檢測非小細胞肺癌H1299細胞周期的變化及細胞凋亡;5.Western blot技術檢測CHAF1A基因敲減后非小細胞肺癌H1299細胞下游靶基因p21、p27、細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、Skp2、cyclin D1等的表達水平。研究結果:1.免疫組化結果顯示:CHAF1A主要在非小細胞肺癌細胞胞漿和細胞膜中表達,與正常肺組織相比,CHAF1A在非小細胞肺癌組織中表達明顯上調;CHAF1A的表達量與非小細胞肺癌患者性別、年齡的關系無統(tǒng)計學意義,而與吸煙與否、腫瘤大小、及腫瘤轉移相關;CHAF1A基因在A549、H1299和H1975細胞中mRNA的ΔCt值均小于9.6,表達豐度高;2.定量PCR結果顯示:siRNA慢病毒感染后,H1299細胞中CHAF1A基因在mRNA水平的表達量受到抑制(p0.05),敲減效率達到84.7%;3.Cellomics計數(shù)表明:CHAF1A基因敲減后細胞數(shù)量明顯降低(162±10 vs.523±8 cells/field,P0.05);克隆形成實驗顯示:CHAF1A基因敲減后H1299細胞形成的克隆數(shù)顯著低于對照組(21±9 vs.84±12 colonies/dish,P0.05;MTT檢測結果顯示:與對照組相比CHAF1A基因敲減后細胞增殖、生長能力明顯下降(P0.05);相比對照組CHAF1A基因敲減后H1299細胞凋亡數(shù)增多(P0.05);4.與對照組相比CHAF1A基因敲減后H1299處于G1期的細胞減少(P0.05),處于S期的細胞增多(P0.05),處于G2/M期的細胞顯著減少(P0.05)。表明CHAF1A基因敲減后H1299出現(xiàn)了S期向G2/M期的轉化減少,細胞阻滯于S期;5.Western blot分析了解CHAF1A基因敲減后下游基因蛋白的變化,結果顯示:H1299細胞CHAF1A基因敲減后cyclin D1、CDK2、Skp2表達下調,p21和p27的表達上調。結論:1.和正常組織相比:CHAF1A mRNA、蛋白在非小細胞肺癌組織中表達上調;肺癌細胞株A549、H1299和H1975中CHAF1A基因表達明顯。2.CHAF1A過度表達與非小細胞肺癌患者臨床病理密切相關,CHAF1A可能是非小細胞肺癌預后的一個重要指標。3.本研究采用siRNA干擾技術,進行慢病毒包裝并感染目的細胞,沉默CHAF1A基因,降低H1299細胞mRNA的表達;成功建立了穩(wěn)定的CHAF1A-siRNA細胞株。4.在非小細胞肺癌H1299,敲減CHAF1A基因使細胞增殖受抑制,克隆形成顯著減少;且H1299細胞凋亡明顯增加。5.CHAF1A基因敲減后H1299細胞S期向G2/M期的轉化減少,細胞阻滯于S期。6.敲減H1299細胞CHAF1A基因后,cyclin D1、CDK2、Skp2表達下調,p21和p27的表達上調,抑制DNA的合成,細胞周期阻滯在S期,限制肺癌細胞的增殖。CHAF1A基因敲減后,H1299細胞的生長、增殖抑制明顯,推測CHAF1A是非小細胞肺癌預防和治療的一個潛在靶點。本研究結果為肺癌的發(fā)病機制及治療靶點的研究提供了新的思路。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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1 劉談珍;CHAF1A基因在非小細胞肺癌細胞中的功能和分子機制研究[D];山西醫(yī)科大學;2017年

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本文編號：1256677