本文關(guān)鍵詞：新生兒缺氧缺血性腦病大鼠模型實驗基礎(chǔ)及臨床研究

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【摘要】：第一部分超聲技術(shù)評價新生大鼠缺氧缺血性腦病模型的實驗研究目的新生兒缺氧缺血性腦病(neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy,NHIE)是新生兒在胎兒期和出生后因為窒息缺氧原因所引起的顱腦損傷,包含出生前胎兒在宮內(nèi)的窘迫以及生后缺氧兩方面原因,是導(dǎo)致新生兒死亡和嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生后遺癥的主要原因,NHIE的病因十分復(fù)雜,并且病變的程度、病變開始的時間很難及時進行辨別,因此需要進行及時的NHIE早期診斷,有助于患兒的早期恢復(fù),以期改善遠期預(yù)后和減少殘疾。本研究通過建立新生大鼠NHIE模型,應(yīng)用二維超聲(two-dimensional ultrasound,2DUS)觀察側(cè)腦室、腦實質(zhì)的聲像圖改變,和多普勒超聲動態(tài)監(jiān)測大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)血流參數(shù)在整個腦缺血缺氧過程中的改變程度,還應(yīng)用聲輻射力脈沖成像(acoustic radiation force impulse imaging,ARFI)技術(shù)評價新生大鼠模型NHIE腦損傷的組織硬度,并與腦組織病理改變進行對比研究,同時對實驗大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)的檢測評分,探討超聲各項指標與新生大鼠不同程度NHIE模型的病理組織學(xué)改變及神經(jīng)行為學(xué)改變之間的關(guān)系。方法1.制作動物模型:選用廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心7日齡的Wistar大鼠108只,分成假手術(shù)組和兩個建模組。假手術(shù)組36只:僅使用眼科器械切開皮膚,鈍性分離大鼠幼崽右側(cè)頸總動脈,不予以結(jié)扎,再直接進行皮膚縫合。模型組1:缺血組36只,直接用絲線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈,縫合傷口;模型組2:缺氧缺血組36只,用絲線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈,之后放回母鼠身邊進行2h的恢復(fù),再將動物模型放入8%的氧和氮氣混合氣體的缺氧箱中,持續(xù)缺氧2h后取出放回母鼠籠中飼養(yǎng)。2.超聲檢查動物模型:三組實驗大鼠分別于術(shù)后3、12、24、48、72h進行超聲檢查。將大鼠的頭顱固定于超聲檢查操作臺上,探頭置于頭部頂骨中線,用2DUS觀察其側(cè)腦室、腦實質(zhì)的病變。應(yīng)用彩色多普勒超聲(Color Doppler flow imaging,CDFI)和脈沖多普勒(pulsed wave Doppler,PW)技術(shù)測定雙側(cè)MCA起始端的收縮期最大血流速度(systoli velocity,Vs)、舒張期末最大血流速度(diastolic velocity,Vd)及阻力指數(shù)(resistance index,RI)。并應(yīng)用ARFI技術(shù)測量實驗大鼠腦組織內(nèi)部剪切波速度(shear wave velocity,SWV)。3.動物模型的組織病理學(xué)檢查:每組隨機選取12只大鼠進行病理組織標本的制作及腦組織病理改變的觀察。使用HE染色觀察雙側(cè)腦組織水腫范圍、神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞狀態(tài),以及腦組織的出血位置和范圍。4.動物模型的神經(jīng)行為學(xué)觀察:將每組剩余的大鼠幼崽飼養(yǎng)至出生后30天進行神經(jīng)行為學(xué)觀察。結(jié)果1.動物模型制模成功率:缺血組在建模過程中有4只大鼠死亡,死亡率為11.11%(4/36),建模成功率為88.89%(32/36)。缺氧缺血組在建模過程中共有6只大鼠死亡,死亡率為16.67%(6/36),建模成功率為83.33%(30/36)。假手術(shù)組:建模過程中無大鼠死亡,建模成功率為100.00%(36/36)。2.動物模型PW檢查結(jié)果:三組術(shù)前Vs、Vd及RI比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。缺血組手術(shù)側(cè)MCA的Vs術(shù)前為10.62±1.28,與術(shù)后3h下降至6.80±1.62相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后12h、24h、48h與前一時間點比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后72h為6.15±1.51,與術(shù)后48h的7.29±1.51相比下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);手術(shù)側(cè)MCA的Vd術(shù)前為3.17±0.69,與術(shù)后3h下降至3.00±0.46相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),于術(shù)后12h上升至3.44±0.65,與術(shù)后3h相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后24h、48h、72h數(shù)值與前一時間點比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);手術(shù)側(cè)MCA的RI術(shù)前為0.69±0.05,與術(shù)后12h下降至0.52±0.07相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后24h、48h數(shù)值與前一時間點比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),于術(shù)后72h下降至0.48±0.10,與前一時間點相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。缺氧缺血組手術(shù)側(cè)MCA的Vs術(shù)前為10.77±1.30,與術(shù)后12h下降至5.97±0.60相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后24h、48h、72h數(shù)值與前一時間點相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);手術(shù)側(cè)MCA的Vd術(shù)前為3.20±0.77,與術(shù)后3h上升至4.20±0.97相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),于術(shù)后12h下降至3.31±0.75,與術(shù)后3h數(shù)值相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后24h、48h、72h數(shù)值與前一時間點比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);手術(shù)側(cè)MCA的RI術(shù)前為0.71±0.03,與術(shù)后3h下降至0.40±0.05相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后12數(shù)值為0.45±0.64,與術(shù)后3h數(shù)值相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后24h、48h數(shù)值與前一時間點比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后72h數(shù)值為0.47±0.06,與術(shù)后48h的0.42±0.08相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);總而言之,與缺血組對比,缺氧缺血組術(shù)后各時間點的RI值均更低下,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.動物模型術(shù)前、術(shù)后的腦組織SWV值:假手術(shù)組術(shù)后各時間點SWV值與術(shù)前比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。缺血組大鼠腦組織SWV值術(shù)前為0.86±0.22,與術(shù)后3h上升至1.34±0.12相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后12h、24h數(shù)值與前一時間點相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后48h上升至1.41±0.12,與術(shù)后24h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后72h與48h數(shù)值相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。缺氧缺血組大鼠腦組織SWV值術(shù)前為0.83±0.20,與術(shù)后3h的1.61±0.08相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后12h與3h數(shù)值相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后24h、48h數(shù)值與前一時間點相比均上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),術(shù)后72h為1.64±0.18與術(shù)后48h的1.76±0.15相比下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)�？偠灾�,缺氧缺血組術(shù)后各時間點SWV值與缺血組相比均更高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.動物模型腦組織HE染色病理改變:假手術(shù)組腦組織分層結(jié)構(gòu)清晰,皮質(zhì)和髓質(zhì)的邊界清楚;神經(jīng)元細胞核可見清楚的核仁、豐富的細胞質(zhì)和Nissl氏體。缺血組腦組織的分層結(jié)構(gòu)尚清晰,可以確定皮質(zhì)和髓質(zhì)邊界;神經(jīng)元細胞核偶可見核破裂,血管周圍腦細胞出現(xiàn)水腫。缺氧缺血組腦組織的分層結(jié)構(gòu)較不明顯,皮質(zhì)和髓質(zhì)的邊界不清楚;神經(jīng)元細胞核偶可見核染色加深,細胞核不清楚,Nissl氏體較少,在小血管中可見大量紅細胞的積聚。5.動物模型神經(jīng)學(xué)測試統(tǒng)計結(jié)果:缺血組與缺氧缺血組的神經(jīng)行為學(xué)測試評分與假手術(shù)組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05):曠場試驗缺血組與缺氧缺血組水平得分及垂直得分均降低(水平得分:缺血組49.81±8.00,缺氧缺血組32.00±5.29,假手術(shù)組63.30±11.60;垂直得分:缺血組9.75±2.08,缺氧缺血組7.21±1.67,假手術(shù)組13.50±3.0),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,(P0.05);懸吊試驗缺血組及缺氧缺血組大鼠在玻璃棒上停留時間均小于假手術(shù)組(缺血組1.38±0.62分鐘,缺氧缺血組0.79±0.70分鐘,假手術(shù)組2.05±0.76分鐘),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);斜坡實驗缺血組及缺氧缺血組大鼠頭部從朝下45度變?yōu)橄蛏洗笥?35度的時間均顯著慢于假手術(shù)組(缺血組4.00±0.73秒,缺氧缺血組7.79±1.63秒,假手術(shù)組2.80±0.83秒),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);拒俘反應(yīng)實驗得分缺血組及缺氧缺血組均大于假手術(shù)組(缺血組3.81±0.75,缺氧缺血組4.85±0.75,假手術(shù)組2.36±0.93),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)�？偠灾�,神經(jīng)行為學(xué)評分:假手術(shù)組缺血組缺氧缺血組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.新生大鼠采取單側(cè)頸總動脈結(jié)扎并聯(lián)合放置缺氧箱的方法制作NHIE模型是模擬人類NHIE的可靠方式。2.新生大鼠模型腦內(nèi)血流動力學(xué)參數(shù)的改變可反映出NHIE早期病變,并與病變程度相對應(yīng),NHIE可導(dǎo)致腦組織層次結(jié)構(gòu)改變、神經(jīng)元數(shù)目減少、神經(jīng)細胞腫脹變形、出血梗死等病理變化。3.ARFI技術(shù)可定量的反映出新生大鼠模型NHIE腦組織的硬度,可準確評估腦損傷程度,其操作簡單、安全系數(shù)高、對組織影響小。4.本組新生大鼠模型可觀察到NHIE引起的神經(jīng)行為學(xué)預(yù)后不良后果,通過神經(jīng)行為學(xué)試驗可評估其損傷程度,并為臨床提供腦損傷后顱腦病變的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。第二部分超聲技術(shù)及格塞爾發(fā)育診斷量表評價新生兒缺氧缺血性腦病的臨床研究目的NHIE可能導(dǎo)致嬰兒死亡率升高以及遠期不良疾病的發(fā)生。重度NHIE可導(dǎo)致嚴重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,對于患兒的遠期不良影響主要包括智力和運動發(fā)育受損、皮質(zhì)盲、神經(jīng)性聽力損失、智力殘疾、腦性麻痹、癲癇和腦癱,嚴重者甚至死亡。ARFI技術(shù)可直觀得到組織硬度特性的信息,與物理觸診相似,具有較廣闊的臨床應(yīng)用前景,并可幾乎適用于人體所有器官。本研究應(yīng)用CDFI和PW檢測新生兒NHIE病例的MCA血流動力學(xué)參數(shù),并使用ARFI技術(shù)評價腦損傷情況,并進行超聲隨訪,與患兒格塞爾發(fā)育診斷量表(Gesell Development Diagnosis Scale,GDDS)結(jié)果進行對比,為臨床早期診斷NHIE和評估預(yù)后提供基礎(chǔ)研究的理論依據(jù)。方法1.應(yīng)用超聲檢查技術(shù)動態(tài)觀察臨床確診NHIE患兒204例,首次檢查時間為出生后3天內(nèi),患兒均無合并感染及先天性心臟病。正常對照組200例。2.觀察指標:應(yīng)用2DUS觀察雙側(cè)腦室及腦實質(zhì)的回聲狀態(tài)。應(yīng)用彩色多普勒超聲從側(cè)囟顯示MCA起始端,運用PW技術(shù)獲取Vs、Vd及RI參數(shù),14天后及1個月后分別返院行顱腦超聲復(fù)查。使用ARFI技術(shù)獲得左、右側(cè)頂葉白質(zhì)區(qū)、大腦鐮部位及雙側(cè)丘腦SWV值。共有131例患兒(足月兒輕度組32例,足月兒中重度組35例,早產(chǎn)兒輕度組34例,早產(chǎn)兒中重度組30例)于出生后4周至8周內(nèi)行第一次GDDS測試,并且10個月后及20個月均行GDDS復(fù)查,以發(fā)育商數(shù)(Development quotient,DQ)記錄智力測試評分。結(jié)果1.2DUS檢查結(jié)果:輕度組表現(xiàn)為局限于側(cè)腦室旁的腦實質(zhì)回聲增強,與脈絡(luò)叢比較回聲稍低,14天后回聲恢復(fù)正常;并室管膜下出血28例,腦室內(nèi)出血15例。中重度組表現(xiàn)為腦實質(zhì)彌漫性的回聲增高,等同或高于脈絡(luò)叢,14天后復(fù)查腦實質(zhì)回聲72例恢復(fù)正常,24例顯示側(cè)腦室擴張聲像,6例腦實質(zhì)內(nèi)探及無回聲囊腔形成;并室管膜下出血34例,腦室內(nèi)出血20例,腦實質(zhì)出血4例。2.CDFI及PW檢查結(jié)果:出生后3天內(nèi)檢測MCA的血流參數(shù),足月兒輕度組、中重度組Vs較對照組下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);輕度組、重度組Vd與對照組相比具有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);三組RI比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。早產(chǎn)兒組輕度組、中重度組Vs與對照組相比下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);輕度組、中重度組Vd與對照組相比下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);三組RI比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。通過繪制RI散點圖發(fā)現(xiàn),足月兒中重度組RI多集中于0.65和0.75兩個范圍,早產(chǎn)兒中重度組RI多集中于0.60和0.80兩個范圍。14天后及1個月后復(fù)查各組大部分患兒血流動力學(xué)參數(shù)趨于好轉(zhuǎn),即Vs上升,Vd上升。通過繪制各組復(fù)診時的RI散點圖顯示出14天復(fù)診時足月兒中重度組RI集中于0.70至0.80范圍,早產(chǎn)兒中重度組RI集中于0.60至0.80范圍;1個月復(fù)診時足月兒中重度組RI集中于0.65至0.75范圍,早產(chǎn)兒中重度組RI集中于0.65至0.80范圍。3.ARFI檢查結(jié)果:由于接受檢查患兒例數(shù)較少(共137例,其中輕度組40例、中重度度組42例和對照組55例),因此足月兒與早產(chǎn)兒合并分析結(jié)果。出生3天內(nèi)使用ARFI技術(shù)檢測腦組織各部位SWV值結(jié)果顯示輕度組、中重度組及對照組各組內(nèi)顱腦頂葉、丘腦SWV值左、右比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)組間兩兩比較,中重度組頂葉、丘腦SWV值高于輕度組和對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),輕度組丘腦SWV值高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。其中有72例NHIE患兒(輕度組34例,中重度組38例)遵醫(yī)囑在初診14天后及1個月后分別兩次返院進行ARFI復(fù)診測量,每次復(fù)診均再次進行腦組織各部位SWV值的測量。結(jié)果顯示輕度組及中重度組兩次復(fù)查頂葉SWV值逐漸下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);雙側(cè)丘腦復(fù)查SWV值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。輕度組及中重度組大腦鐮SWV數(shù)值兩次復(fù)診與初診相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.NHIE患兒GDDS及神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后結(jié)果:行初次超聲檢查之后,早產(chǎn)兒輕度組有1例患兒因合并重癥肺炎及敗血癥而死亡,足月兒中重度組有1例患兒因合并腎功能不全死亡,早產(chǎn)兒中重度組有2例患兒死亡,各組間患兒死亡率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)過10個月及20個月患兒的發(fā)育及康復(fù)訓(xùn)練等治療措施后,各組各項GDDS評分兩次復(fù)診與初診相比DQ評分均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),各組神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥發(fā)生率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),20個月的DQ顯示,足月兒輕度組早產(chǎn)兒輕度組足月兒中重度組早產(chǎn)兒中重度組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.CDFI及PW檢測MCA血流動力學(xué)參數(shù)能在一定程度上反映出NHIE病變水平,對臨床早期診斷及后期動態(tài)隨訪新生兒腦損傷具有參考價值。2.超聲ARFI技術(shù)目前可初步用于評估新生兒NHIE病變水平,為臨床早期診斷提供參考數(shù)據(jù)。然而由于該技術(shù)的部分局限性,更完善的彈性成像技術(shù)對于NHIE的診斷價值有待進一步研究。3.NHIE對患兒的神經(jīng)行為學(xué)發(fā)育狀況影響可通過格塞爾發(fā)展診斷量表進行早期評估及遠期隨訪。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742;R-332

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本文編號：1256201