本文關(guān)鍵詞：基于BMMNCs的骨再生策略在骨缺損修復(fù)中的動物實驗與臨床研究

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【摘要】：背景和目的骨缺損的修復(fù)是臨床治療的巨大挑戰(zhàn),傳統(tǒng)的自體骨移植因來源有限和供區(qū)損傷等問題具有很大的局限性。組織工程骨的發(fā)展為骨缺損治療開辟了嶄新的途徑。然而,體外培養(yǎng)組織工程骨過程復(fù)雜且成本高昂,已經(jīng)開展的臨床試驗數(shù)量很少,因此,組織工程骨尚不能常規(guī)進入臨床使用。由于骨髓血中富含骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),新鮮采集的骨髓血常被用于輔助骨缺損的修復(fù),通過將骨髓血中的骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)濃縮富集,可提高干細胞的濃度。近年來,已經(jīng)有許多直接運用濃縮骨髓進行骨缺損修復(fù)的臨床報道,并且開始逐漸推廣。這種方法與經(jīng)典的組織工程骨相比,二者修復(fù)效果有何差別尚無相關(guān)報道,特別是缺乏詳細的大動物實驗研究。為此,我們在大動物體內(nèi)構(gòu)建節(jié)段性骨缺損模型,以β-磷酸三鈣(tricalcium phosphate,TCP)為支架,比較運用BMMNCs和經(jīng)體外培養(yǎng)擴增的BMSCs修復(fù)骨缺損的差異,并進行了長達一年的觀察。我們用多種先進的技術(shù)手段對兩種方法形成的再生骨組織進行了形態(tài)、化學(xué)構(gòu)成及生物力學(xué)的研究和比較,并找到了再生骨組織與自體正常骨組織之間的差異。此外,我們首次使用BMMNCs復(fù)合β-TCP修復(fù)臨床齒槽裂骨缺損,并通過三維CT與傳統(tǒng)的自體骨移植進行了為期一年的隨訪比較,為BMMNCs進一步的臨床應(yīng)用打下了重要的基礎(chǔ)。研究方法1.制備BMMNCs/β-TCP和BMSCs/β-TCP兩種移植物:從比格犬髂后上嵴抽取骨髓血15 ml,以Ficoll密度梯度離心法制備BMMNCs,將其體積濃縮為500μl,然后接種至加工好的圓柱形β-TCP支架上。用瑞氏-姬姆薩染色觀察處理前后骨髓血成分的變化,同時以犬細胞因子芯片測量BMMNCs中常見細胞因子的含量,并與外周血、未濃縮骨髓血作比較。同樣方法抽取15 ml骨髓血,從中分離培養(yǎng)BMSCs,擴增至P1代時,調(diào)整細胞濃度為20×l06/ml,體積500 μl,接種至相同支架上,換用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)14天。以CM-Dil染料染色后在共聚焦顯微鏡下觀察兩種移植物細胞分布情況。2.比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損的修復(fù):建立比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損模型,應(yīng)用制備好的BMMNCs/β-TCP移植物、BMSCs/β-TCP移植物進行修復(fù),以單純β-TCP支架和空白處理作為對照。術(shù)后2周,3月,6月,12月分別行X線觀察,術(shù)后12月行SPECT-CT檢查,12月取材后通過大體觀察,Micro-CT,硬組織切片組織學(xué)檢查評價修復(fù)效果。3.再生骨組織的微觀結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成與生物力學(xué)分析:以BMMNCs/β-TCP和BMSCs/β-TCP兩種典型的方法修復(fù)比格犬脛骨節(jié)段性骨缺損,術(shù)后12月取材,同時取對側(cè)自體骨為對照,樣本包埋并打磨后,以雙光子和二次諧波顯微顯像的方法檢測骨組織的膠原和血管等細微結(jié)構(gòu),以激光拉曼光譜檢測骨組織化學(xué)成分,以納米壓痕儀檢測骨組織微觀力學(xué)性能。4.BMMNCs復(fù)合β-TCP修復(fù)臨床齒槽裂:首先定量分析齒槽裂缺損的體積,采用三維打印和計算機輔助法計算骨缺損區(qū)域體積,以明確所需移植物量;然后分別以BMMNCs復(fù)合β-TCP和自體髂骨移植物進行骨缺損修復(fù)。術(shù)后3月,6月,12月進行三維CT影像學(xué)分析,評估缺損修復(fù)情況和移植物變化。結(jié)果1.從比格犬15 ml骨髓血中平均獲取BMMNCs濃度為33.0±8.8×106/ml,濃縮后可見其成分主要為有核細胞,而紅細胞含量大幅下降,細胞在β-TCP支架上均勻散在分布,鏡下呈圓形。細胞因子分析顯示,IL-8在BMMNCs中明顯高于外周血和未濃縮的骨髓血,而BMMNCs和骨髓血中晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor of advanced glycation end products,RAGE)和干細胞因子(stem cell factor,SCF)的濃度則較外周血低。15 ml骨髓血經(jīng)培養(yǎng)擴增后獲得BMSCs細胞濃度為20×106/ml,體外成骨誘導(dǎo)成功,細胞在支架上交織成網(wǎng)狀緊密黏附。2.比格犬脛骨節(jié)段性缺損修復(fù)實驗中,BMMNCs組表現(xiàn)出更好的修復(fù)效果,該組80%的動物均在術(shù)后3月即形成了明顯的骨連接,取出內(nèi)固定后無再骨折發(fā)生;術(shù)后12月可見骨痂改建,骨皮質(zhì)密度增加,髓腔形成,移植物與自體骨組織銜接良好,無明顯分界。在BMSCs組中,術(shù)后3月與6月截骨線仍明顯,無法及時拆除內(nèi)固定,移植物與自體脛骨分界清晰,大量支架未能降解,支架周圍骨質(zhì)菲薄,但支架內(nèi)部可見較多的骨組織形成。單純支架組的移植物術(shù)后6月幾乎完全吸收。SPECT-CT示BMMNCs組移植物區(qū)域較BMSCs組有更明顯的放射性濃聚,表明其代謝活躍。Micro-CT分析BMMNCs組平均骨組織體積為1231.38 mm3,骨組織占比65.14%。BMSCs組平均骨組織體積為755.65 mm3,骨組織占比41.29%,二者差異具有顯著性。3.雙光子和二次諧波信號顯示BMMNCs組樣本的膠原纖維貼附于孔壁,呈層狀排列,或在孔中央呈同心圓樣排列形成類哈弗斯管結(jié)構(gòu),骨細胞位于膠原層之間,血管位于膠原中央或貼附于材料孔壁上。在BMSCs組樣本中,可見膠原纖維呈束狀由孔壁或聯(lián)通孔處發(fā)散,密度較BMMNCs組低,同心圓結(jié)構(gòu)不明顯。拉曼光譜檢測顯示BMMNCs組樣本、BMSCs組樣本和自體脛骨組織的峰位相似,但強度不同。BMNNCs組的礦物/基質(zhì)比顯著高于BMSCs組;碳酸/磷酸比在自體骨組織中較再生骨組織低;膠原交聯(lián)比在BMMNCs組樣本中較自體骨低,但在BMSCs組則與自體骨無顯著差異;碳酸/氨基酸I比值在BMMNCs組中顯著升高,可見該組樣本中存在很活躍的骨改建活動。納米壓痕結(jié)果顯示BMMNCs組樣本的壓痕模量為15.61 Gpa,硬度為0.67 Gpa,與自體骨組織相似,并顯著高于BMSCs組。4.術(shù)前齒槽裂患者的骨缺損體積在3D打印模型上計算所得平均值為1.52ml,略高于通過計算機輔助工程(computer aided engineering,CAE)軟件計算的體積(1.47ml),二者無顯著差異,兩種方法均適用于齒槽裂的術(shù)前評估。在齒槽裂修復(fù)研究中,所有的患者術(shù)區(qū)均愈合良好,沒有嚴重并發(fā)癥出現(xiàn)。BMMNCs組多數(shù)患者(8/10)的齒槽裂得到了較好的修復(fù),形成了骨連接。術(shù)后3月,BMMNCs組移植物的平均體積為724.5 ± 220.5 mm3。術(shù)后六月,移植物體積降低至612.2 ±211.5 mm3。術(shù)后12月平均BV與術(shù)后六月相似,為589.0 ± 180.5 mm3。自體髂骨組與BMMNCs組相似,術(shù)后6月移植物平均體積為678.7 ±211.0 mm3與BMMNCs組相似,術(shù)后12月移植物平均體積與6月時相似,為635.3 ± 197.5 mm3。兩種方法相比無顯著差異。結(jié)論1.在比格犬脛骨節(jié)段性缺損的修復(fù)中,采用直接濃縮制備的BMMNCs結(jié)合β-TCP材料比采用經(jīng)體外培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)后的BMSCs效果更好。2.與BMSCs相比,BMMNCs結(jié)合β-TCP策略形成的骨組織更加豐富,其化學(xué)成分、生物力學(xué)性質(zhì)也與自體骨組織更加接近。3.在齒槽裂修復(fù)中,缺損體積在術(shù)前通過3D打印模型和CAE軟件計算均能較準確地獲取,術(shù)者可通過每個患者的具體情況靈活選擇適合的體積評估方法。4.BMMNCs復(fù)合β-TCP顆粒在修復(fù)齒槽裂缺損中的效果與自體髂骨移植相當,但該方法與自體髂骨移植一樣,在術(shù)后6月內(nèi)會出現(xiàn)明顯的移植物吸收。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R687

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1 張秀慧;;自體合成移植物——實驗和臨床研究[J];國外醫(yī)學(xué).耳鼻咽喉科學(xué)分冊;1984年01期

2 袁波;;癌癥與移植物有關(guān)[J];國外醫(yī)學(xué)情報;1989年15期

3 陸清聲,景在平,趙志青,包俊敏,趙 s，

本文編號：1255938