本文關鍵詞：EZH2及其介導的STAT3甲基化在常染色體顯性多囊腎病中的作用研究

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【摘要】：研究背景及目的常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)是由單基因突變引起的遺傳性腎臟疾病,也是最常見的遺傳性腎病。它主要由PKD1或PKD2基因突變引起。其主要病理特點是腎囊腫形成,并逐漸增大壓迫替代正常腎組織引起腎功能惡化,最終導致腎衰竭。ADPKD患病率為1-2.5‰,通常發(fā)生在30歲至40歲,約占終末期腎病患者病因8-10%。近年來多囊腎病的研究取得一定進展,但目前尚無有效的逆轉其進程的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)起源于正常腎小管上皮細胞的囊腫襯里上皮細胞不斷增殖、去分化是多囊腎病發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素,這與良性腫瘤的增殖有許多相似之處。Enhancer of zeste homolog 2(EZH2)是一種組蛋白賴氨酸甲基轉移酶,能夠催化組蛋白H3第27賴氨酸三甲基化,參與眾多生命過程。研究發(fā)現(xiàn)EZH2在多種實體腫瘤中高表達,如肺癌、膀胱癌、卵巢癌,已經成為腫瘤治療的熱點和新靶點。EZH2介導的非組蛋白甲基化是十分重要的翻譯后修飾,參與許多生命過程,如細胞周期、DNA修復、細胞衰老、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生。我們實驗室前期分析芯片數據,結果顯示在大鼠多囊腎組織中EZH2高表達,其表達隨大鼠周齡增加而增加,提示EZH2可能在多囊腎病中起作用。目前,國內外尚無多囊腎病與EZH2關系的報道,EZH2在多囊腎病中的作用尚待研究。本研究擬從細胞、組織、器官及整體水平,探索EZH2作為多囊腎病治療新靶點的的價值,研究EZH2介導的STAT3甲基化在多囊腎病發(fā)病中的作用和機制,從而為多囊腎病尋找新的治療靶點提供理論基礎和實驗依據。內容主要分以下4部分。第一部分EZH2在多囊腎組織中的表達和活性目的:明確EZH2在人、鼠多囊腎組織中的表達情況方法:收集人多囊腎組織及正常對照腎組織標本、Pkd1敲除小鼠及野生型小鼠腎組織標本,運用PCR、Western Blot方法,檢測EZH2在多囊腎組織中的表達,并通過檢測其特異性底物組蛋白H3第27賴氨酸甲基化含量來反映EZH2活性。結果:EZH2 mRNA水平和蛋白水平在多囊腎病患者腎組織中均明顯高于正常對照組,且酶活性升高;EZH2在Pkd1敲除小鼠多囊腎組織中的表達及活性顯著高于野生型組。結論:EZH2在多囊腎組織中的表達和活性顯著升高。第二部分 EZH2抑制劑對囊腫襯里上皮細胞增殖及pkd1敲除小鼠腎囊腫生長的作用及機制目的:觀察EZH2選擇性抑制劑gsk126對多囊腎病囊腫襯里上皮細胞增殖及pkd1敲除小鼠腎功能和腎囊腫的作用及機制。方法:應用EZH2選擇性抑制劑gsk126處理對數期生長的多囊腎病囊腫襯里上皮細胞(wt9-12),用mtt法測定其對wt9-12細胞增殖的抑制作用,用ldh毒性釋放實驗檢測gsk126對wt9-12細胞的毒性作用;采用pkd1敲除小鼠腹腔注射EZH2選擇性抑制劑gsk126,3周后留取組織標本和血清,觀察小鼠腎重/體重、血肌酐、血尿素氮等腎功能指標變化,探索EZH2作用多囊腎病新靶點的治療作用;構建EZH2質粒、干擾rna,在wt9-12細胞中過表達和抑制EZH2,通過westernblot研究EZH2對多囊腎病囊腫襯里上皮細胞stat3活性的作用,并在pkd1敲除小鼠模型中驗證。結果:EZH2選擇性抑制劑gsk126抑制多囊腎病細胞增殖,且抑制增殖的藥物濃度對細胞無毒性作用;EZH2選擇性抑制劑gsk126延緩pkd1敲除小鼠囊腫增長,降低pkd1敲除小鼠腎重/體重,降低pkd1敲除小鼠血肌酐、血尿素氮水平,改善pkd1敲除小鼠腎功能;在囊腫襯里上皮細胞wt9-12中,通過質粒轉染過表達EZH2引起stat3的活性增加,通過EZH2選擇性抑制劑gsk126和(或)干擾rna下調EZH2表達,導致stat3磷酸化呈現(xiàn)濃度依賴性降低;EZH2選擇性抑制劑gsk126抑制pkd1敲除小鼠腎組織中stat3活性。結論:EZH2抑制劑能夠抑制囊腫襯里上皮細胞增殖,延緩pkd1敲除小鼠腎囊腫的進展,改善pkd1敲除小鼠腎功能,EZH2可能成為多囊腎病治療的新靶點;EZH2通過調節(jié)stat3磷酸化活性參與影響多囊腎病的進展。第三部分過表達EZH2促進斑馬魚腎囊腫的形成目的:過表達EZH2觀察其促進斑馬魚腎囊腫的形成。方法:利用pcs2-egfp作為載體,通過限制性內切酶bamhi/xhoi構建斑馬魚pcs2-EZH2-egfp質粒,將質粒利用noti線性化通過試劑盒轉錄合成EZH2全長mrna。通過顯微注射在斑馬魚中過表達EZH2,觀察過表達EZH2是否能夠促進斑馬魚產生前腎囊腫。結果:過表達EZH2,部分斑馬魚出現(xiàn)前腎囊腫,比例為17.1%±9.8%,空白載體對照組斑馬魚無前腎囊腫產生。結論:EZH2參與并促進斑馬魚腎囊腫的形成。第四部EZH2及其介導的STAT3甲基化在多囊腎病發(fā)病機制中作用目的:探索EZH2在多囊腎病中表達增加的機制以及EZH2介導的STAT3甲基化在多囊腎病發(fā)病機制中的作用。方法:通過cAMP激活劑(Forskolin)、cAMP類似物(8-Br-camp)和競爭性抑制劑(Rp-camp)、PKA激活劑(H89)探索cAMP/PKA通路對EZH2在多囊腎病中表達和活性的影響;通過免疫共沉淀和Western blot探索在ADPKD中EZH2與STAT3是否能夠直接結合、相互作用,在多囊腎病中STAT3的甲基化是否高表達;通過免疫共沉淀和Western blot探索EZH2選擇性抑制劑GSK126能否抑制STAT3甲基化進而調節(jié)STAT3活性。結果:cAMP激活劑(Forsklin)、c AMP類似物(8-Br-camp)增加囊腫襯里上皮細胞WT9-12中EZH2的表達和活性,c AMP競爭性抑制劑(Rp-camp)、PKA激活劑(H89)下調WT9-12細胞中EZH2的表達和活性。在多囊腎病患者腎組織和WT9-12細胞中,EZH2均能與STAT3直接結合;在多囊腎病患者腎臟組織中STAT3甲基化高表達;EZH2選擇性抑制劑GSK126抑制WT9-12細胞中STAT3甲基化,進而調節(jié)STAT3磷酸化活性。結論:在多囊腎病中EZH2的表達受c AMP/PKA通路的調節(jié),EZH2調節(jié)STAT3甲基化,進而調節(jié)STAT3活性,在多囊腎病進展中起到重要作用。小結:
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692.1

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