本文關鍵詞：舒巴坦通過p38 MAPK通路介導GLT-1上調(diào)參與誘導大鼠腦缺血耐受

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【摘要】：缺血性腦疾病以其致死率高、致殘率高的特點嚴重威脅著人類健康。隨著當前中國社會老齡化程度日益加重,以及社會生活、工作節(jié)奏的日益加快,缺血性腦疾病在臨床呈現(xiàn)多發(fā)勢態(tài),且呈現(xiàn)越來越年輕化的趨勢。此外,一些可以預知的臨床缺血性改變,如神經(jīng)外科手術、心臟外科手術、合并心腦血管疾病患者的大手術時血流的停滯帶來的心、腦缺血性損傷也是亟待解決的問題。在疾病發(fā)生前后,充分調(diào)動機體內(nèi)源性保護機制,使神經(jīng)細胞在遭受缺血打擊時減輕損傷,是此類疾病的預防和治療過程中的關鍵因素之一。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),與生理情況下大腦功能的維持密切相關。然而,在缺血性腦疾病發(fā)生時,缺血、缺氧狀態(tài)的出現(xiàn)造成谷氨酸大量釋放到突觸間隙內(nèi),同時腦內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運異常,使神經(jīng)細胞外的谷氨酸濃度明顯升高。微透析實驗顯示,在腦缺血發(fā)生時,腦組織細胞外的谷氨酸濃度可以由正常的1-5μM升高到16-30μM。過量的谷氨酸引起神經(jīng)細胞的過度興奮是導致神經(jīng)元損傷的重要機制。因此,改善腦內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運過程,以維持突觸間隙內(nèi)谷氨酸濃度的正常是腦缺血性疾病時保護神經(jīng)細胞的重要手段。突觸間隙內(nèi)谷氨酸濃度的穩(wěn)定主要依賴高親和性興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體(excitatory amino acid transporters,EAATs)系統(tǒng)維持。至今已發(fā)現(xiàn)了5種高親和性谷氨酸轉(zhuǎn)運體,即EAAT 1-5,其中EAAT2主要分布在星形膠質(zhì)細胞的細胞膜上,又被稱為膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(glial glutamate transporter-1,GLT-1)。GLT-1在谷氨酸穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著重要作用,突觸間隙中超過90%的谷氨酸依靠GLT-1的轉(zhuǎn)運而清除。在腦內(nèi)谷氨酸濃度升高時,通過GLT-1的跨膜轉(zhuǎn)運能高效的清除突觸間隙內(nèi)的谷氨酸,使其維持正常的濃度,防止谷氨酸濃度過度增高引起神經(jīng)細胞的過度興奮而造成損傷。因此,GLT-1在缺血性腦損傷的發(fā)生以及腦缺血耐受的誘導過程中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示,全腦缺血造成大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的m RNA和蛋白合成均降低,同時海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性死亡(delayed neuronal death,DND)。我室既往研究顯示,通過腦缺血預處理可以增加大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達,同時神經(jīng)細胞對缺血的耐受性增強;而應用反義寡核苷酸技術阻斷GLT-1的表達或應用特異性抑制劑阻斷GLT-1的功能后,腦缺血預處理介導的神經(jīng)保護作用也被阻斷。綜上,對GLT-1蛋白表達和功能進行調(diào)制,有可能成為缺血性腦疾病的預防和治療的一個新靶點。既往研究表明,β-內(nèi)酰胺類抗生素可以促進腦內(nèi)GLT-1蛋白表達,增強星形膠質(zhì)細胞對突觸間隙內(nèi)谷氨酸的清除能力,改善腦內(nèi)谷氨酸循環(huán)過程,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。這一發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)細胞缺血耐受的研究中備受關注。研究發(fā)現(xiàn),氨芐青霉素預處理可以上調(diào)GLT-1蛋白表達,抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性,從而對前腦缺血小鼠的海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。在大腦中動脈阻塞的局灶性缺血模型中,預先應用頭孢曲松鈉可以上調(diào)GLT-1表達,增強谷氨酰胺合成酶活性,使腦梗死體積明顯縮小。大鼠大腦中動脈阻塞后應用頭孢曲松鈉,可以增強GLT-1的活性,同時使梗死區(qū)內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子增多,有效降低腦缺血造成的神經(jīng)損傷。我室既往研究發(fā)現(xiàn),應用頭孢曲松鈉預處理可以上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達,增強膠質(zhì)細胞對突觸間隙內(nèi)谷氨酸的攝取能力,使神經(jīng)細胞在隨后發(fā)生的致死性缺血打擊中得以存活。這些發(fā)現(xiàn)在缺血性腦損傷類疾病的防治中具有積極的意義,但是鑒于頭孢曲松鈉為一線抗生素,抗菌作用強大,臨床大量使用會帶來諸如菌群失調(diào)、耐藥菌株出現(xiàn)等多種不良后果。這些不良后果大大限制了頭孢曲松鈉應用于臨床缺血性腦損傷的防治研究。因此,積極尋找副作用小的替代品,對上述研究成果的臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。舒巴坦(sulbactam)的化學結(jié)構(gòu)中也具有β-內(nèi)酰胺環(huán),與頭孢曲松鈉相似,但是其抗菌作用遠遠弱于頭孢曲松鈉,臨床上一般與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合用藥,以增強其抗菌效應。我室在近期的研究中發(fā)現(xiàn),對大鼠應用舒巴坦預處理可以通過調(diào)制海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白的表達,增強神經(jīng)元的抗缺血耐受能力。鑒于舒巴坦的抗菌活性較弱,副作用較小,深入研究舒巴坦上調(diào)GLT-1的表達和功能、進而發(fā)揮神經(jīng)元保護作用的機制,可為舒巴坦在抗缺血性腦損傷方面的應用和研究提供理論和實驗依據(jù),具有重要的意義。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,廣泛分布于機體各種細胞內(nèi)。MAPKs信號轉(zhuǎn)導通路主要包括ERK(extracellular signal-Regulated kinase,ERK)、JNK(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38 MAPK和BMK(big MAPKinase,BMK),是細胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導機制,通過調(diào)節(jié)目的蛋白合成,參與細胞增殖、轉(zhuǎn)化、分化及凋亡等過程。p38 MAPK屬于應激性蛋白激酶,其在缺血性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。在大鼠大腦中動脈栓塞局灶性腦缺血模型的研究中,通過缺氧預處理可以使梗死區(qū)周圍p38 MAPK的表達增加,同時這一區(qū)域的神經(jīng)細胞對缺血性打擊的耐受性增強,這種保護作用隨著p38 MAPK的表達被抑制而減弱。我室系列研究發(fā)現(xiàn),腦缺血預處理可以適度上調(diào)p38 MAPK的表達,進而增加GLT-1的表達而誘導腦缺血耐受,應用p38 MAPK通路的特異性抑制劑或AS-ODNs阻斷p38MAPK通路的活動,腦缺血預處理誘導的腦缺血耐受效應也被阻斷。據(jù)此,我們設想,p38 MAPK信號通路可能參與介導舒巴坦誘導的GLT-1上調(diào)和神經(jīng)細胞保護作用。為證實此設想,本研究應用大鼠全腦缺血模型,觀察舒巴坦對海馬CA1區(qū)p38 MAPK磷酸化蛋白(p-p38 MAPK)和GLT-1表達的影響,同時應用p38 MAPK通路特異性抑制劑SB203580,觀察其對舒巴坦誘導的GLT-1表達上調(diào)和腦缺血耐受的影響,探討p38MAPK在舒巴坦誘導的GLT-1上調(diào)和腦缺耐受中的作用,為缺血性腦疾病的防治提供理論基礎。第一部分舒巴坦對大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK和GLT-1表達的影響目的:觀察給正常大鼠或四血管閉塞全腦缺血大鼠側(cè)腦室注射舒巴坦后,海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK和GLT-1蛋白的表達,對比p-p38 MAPK和GLT-1蛋白表達的時間關系,為確定舒巴坦通過p38 MAPK通路上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達提供依據(jù)。方法:健康雄性Wistar大鼠60只,側(cè)腦室埋置給藥套管后隨機分為以下幾組:1溶劑對照(NS+sham)組(n=5)首先給大鼠側(cè)腦室一次性注射舒巴坦溶劑生理鹽水(normal saline,NS)10μl,之后即刻進行全腦缺血的sham手術。2舒巴坦+sham組(n=5)首先給大鼠側(cè)腦室一次性注射舒巴坦溶液(360 nmol,10μl),之后即刻進行全腦缺血的sham手術。3全腦缺血(NS+全腦缺血)組(n=5)首先給大鼠側(cè)腦室注射舒巴坦的溶劑NS 10μl,之后即刻進行8 min的全腦缺血手術。4舒巴坦+全腦缺血組(n=5)首先給大鼠側(cè)腦室注射舒巴坦溶液(360 nmol,10μl),之后即刻進行8 min的全腦缺血手術。各組大鼠分別于側(cè)腦室注射后6 h、12 h和48 h取材,應用免疫組織化學和western blot方法,觀察海馬CA1區(qū)p-p38 M APK和GLT-1蛋白的表達情況,對比p-p38 MAPK和GLT-1蛋白表達的時間關系。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示,溶劑對照(NS+sham)組大鼠海馬CA1區(qū)有一定量的p-p38 MAPK和GLT-1的基礎表達,呈現(xiàn)淺棕黃色顆粒,各時間點相比較,p-p38 MAPK、GLT-1蛋白免疫陽性染色未見明顯的改變。側(cè)腦室給予舒巴坦(舒巴坦+sham組)后,p-p38 MAPK、GLT-1蛋白的免疫陽性著色均有不同程度的上調(diào),p-p38 MAPK陽性顆粒主要位于細胞核內(nèi),GLT-1陽性染色緊緊包繞著神經(jīng)元,呈現(xiàn)典型的“網(wǎng)格”狀圖像;p-p38MAPK和GLT-1兩者表達上調(diào)的時間不同,與溶劑對照(NS+sham)組比較,給予舒巴坦6 h后大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK的陽性染色明顯增強,達到高峰,12 h開始回落,48 h已接近溶劑對照組水平(P0.05);而GLT-1的表達高峰要遲于p-p38 MAPK,在給予舒巴坦后12 h GLT-1的陽性染色開始增強,48 h達到高峰(P0.05)。全腦缺血(NS+ischemia組)引起大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK表達升高,表現(xiàn)為與溶劑對照(NS+sham)組相比較,免疫陽性染色明顯增強,缺血后12 h達高峰(P0.05),約為溶劑對照組的2倍,48 h逐漸回落;全腦缺血后各時間點GLT-1的表達未見明顯改變。舒巴坦+全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK和GLT-1的表達均有不同程度的增加,與溶劑對照(NS+sham)組相比較,p-p38 MAPK的表達在給予舒巴坦后6 h達到高峰(P0.05),12 h逐漸回落至sham水平;GLT-1的表達在給舒巴坦后12 h開始升高,48 h達高峰(P0.05);此外,與全腦缺血(NS+ischemia)組相比較,給予舒巴坦后抑制了全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK的過度表達,表現(xiàn)為表達的峰值低于全腦缺血組。Western blot檢測結(jié)果與免疫組化呈現(xiàn)相似的趨勢,無論是正常大鼠還是全腦缺血大鼠,給予舒巴坦后均引起p-p38 MAPK和GLT-1蛋白表達的上調(diào)(P0.05),且均表現(xiàn)為GLT-1的表達上調(diào)的時間遲于p-p38 MAPK的表達上調(diào),具體表達上調(diào)時間點與免疫組化結(jié)果相同。綜上,無論正常大鼠還是全腦缺血大鼠,應用舒巴坦預處理后海馬CA1區(qū)GLT-1、p-p38 MAPK的表達均有增高,但其表達的時間呈現(xiàn)明顯的先后順序,GLT-1的表達上調(diào)的時間遲于p-p38 MAPK的表達上調(diào),提示舒巴坦可能通過p38 MAPK通路促進GLT-1的表達上調(diào)。第二部分抑制p38 MAPK信號通路對舒巴坦引起的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白上調(diào)的影響目的:為進一步明確p38 MAPK信號通路在舒巴坦預處理上調(diào)GLT-1表達和神經(jīng)細胞保護中的作用,應用p38 MAPK信號通路的特異性抑制劑SB203580抑制p38 MAPK的功能后,分別觀察舒巴坦對sham及全腦缺血大鼠GLT-1表達的影響,從而證明舒巴坦是否通過p38 MAPK信號通路介導GLT-1表達上調(diào)參與誘導腦缺血耐受。方法:健康雄性Wistar大鼠35只,側(cè)腦室埋置給藥套管后隨機分為以下幾組,每組n=5:1溶劑對照(NS+sham)組(n=5):同第一部分;2舒巴坦(舒巴坦+sham)組(n=5):同第一部分;3 SB203580+舒巴坦組(n=5):首先給大鼠側(cè)腦室注射SB203580(5nmol,10μl),30 min后按第一部分中“舒巴坦+sham組”方法,側(cè)腦室內(nèi)注射舒巴坦溶液及進行全腦缺血的sham手術;4 SB203580+sham組(n=5):首先給大鼠側(cè)腦室注射SB203580溶液(5 nmol,10μl),隨后即刻進行全腦缺血的sham手術。5全腦缺血組(NS+全腦缺血)組(n=5):同第一部分6舒巴坦+全腦缺血組(n=5):同第一部分;7 SB203580+舒巴坦+全腦缺血組(n=5):首先給大鼠側(cè)腦室注射SB203580溶液(5 nmol,10μl),30 min后按第一部分“舒巴坦+全腦缺血組”的方法,進行側(cè)腦室注射舒巴坦溶液及全腦缺血。各組大鼠分別于側(cè)腦室注射舒巴坦溶液后48 h取材,應用免疫組化和western blot的方法,觀察海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白表達的變化。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示,溶劑對照(NS+sham)組大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1有一定量的表達,側(cè)腦室給予舒巴坦(舒巴坦+sham組)后48 h,大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的陽性染色明顯增強(P0.05)。與舒巴坦(舒巴坦+sham)組比較,預先給予SB203580(SB203580+舒巴坦組)后海馬CA1區(qū)GLT-1的陽性染色明顯減弱(P0.05)。與全腦缺血(NS+ischemia)組相比,預先給予舒巴坦(sulbactam+ischemia)可明顯上調(diào)全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達。與舒巴坦+全腦缺血組相比較,預先給予SB203580后大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的陽性染色明顯減弱(P0.05)。與溶劑對照(NS+sham)組比較,單獨應用SB203580后大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白陽性染色未見明顯改變。Western blot檢測結(jié)果與免疫組化結(jié)果顯示相似的趨勢,無論是正常大鼠還是全腦缺血大鼠,給予舒巴坦后均可引起海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白表達的上調(diào)(P0.05),而應用SB203580后,均可使舒巴坦引起的海馬CA1區(qū)GLT-1的表達上調(diào)明顯減少(P0.05)。上述結(jié)果表明,無論是正常大鼠還是腦缺血大鼠,應用SB203580抑制了p38 MAPK通路活性后,均顯著抑制了舒巴坦介導的海馬CA1區(qū)GLT-1表達的上調(diào),提示p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路參與舒巴坦介導的GLT-1蛋白表達上調(diào)。第三部分抑制p38 MAPK信號通路對舒巴坦抗大鼠腦缺血作用的影響目的:本研究中第一、二部分實驗結(jié)果證實,p38 MAPK參與了舒巴坦介導的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達上調(diào)。在此基礎上,本部分實驗進一步觀察應用p38 MAPK通路的特異性抑制劑(SB203580)抑制p38MAPK的功能后,對舒巴坦抗大鼠腦缺血作用的影響,進一步證明舒巴坦通過p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路介導GLT-1表達上調(diào)而發(fā)揮抗缺血性神經(jīng)元損傷作用。方法:健康雄性Wistar大鼠25只,側(cè)腦室預置給藥套管后,隨機分為以下五組,每組n=5:1 Sham組:首先側(cè)腦室注射NS 10μl,2d后行全腦缺血的sham手術;2全腦缺血組:首先側(cè)腦室注射NS 10μl,2d后行8min全腦缺血;3舒巴坦+全腦缺血組:首先給大鼠側(cè)腦室注射舒巴坦溶液(360 nmol,10μl),2d后進行8 min全腦缺血。4 SB203580+舒巴坦+全腦缺血組:首先給大鼠側(cè)腦室注射SB203580溶液(5 nmol,10μl),30分鐘后給予舒巴坦(360 nmol,10μl)側(cè)腦室注射,2d后行全腦缺血,方法同舒巴坦+腦缺血組;5 SB203580+sham組:首先給大鼠側(cè)腦室注射SB203580(5 nmol,10μl),30min后按照sham組的方法,注射NS及行腦缺血sham手術。全腦缺血sham手術或全腦缺血再灌注后7 d斷頭處死動物,分離雙側(cè)海馬,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋切片,硫堇染色,通過分析比較大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的組織學分級(histological grading,HG)和神經(jīng)元密度(neuronal density,ND),確定不同條件下神經(jīng)元遲發(fā)型死亡情況,評價舒巴坦的抗缺血性神經(jīng)元損傷作用。結(jié)果:sham組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元約為3-4層,整齊、致密排布,可見清晰、完整的細胞輪廓,胞內(nèi)可見大量尼氏體著色,細胞核充實飽滿,核仁清晰可見。HG為0-Ⅰ級,ND為198.6±7.89(cells/mm,下同)。給予8 min全腦缺血,引起了海馬CA1區(qū)明顯的神經(jīng)元損傷,鏡下可以看到大片錐體神經(jīng)元破壞、死亡,細胞排列疏松、紊亂,散在大量細胞碎片,殘存的細胞收縮,呈不規(guī)則狀,核濃染,核仁消失;與sham組相比較,HG(Ⅱ-Ⅲ級)明顯升高(p0.01),ND(51.8±7.40)明顯減低(p0.01)。舒巴坦+缺血組僅有散在細胞死亡,大部分細胞可見清晰、完整的細胞輪廓,整齊排列,層次清晰;與全腦缺血組相比較,HG(Ⅰ-Ⅱ級)明顯減低(p0.05),ND明顯升高(p0.05),為188.6±12.76。這些結(jié)果表明,舒巴坦可發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用,使神經(jīng)細胞對缺血打擊的耐受性增強。預先給予SB203580(SB203580+舒巴坦+缺血組)阻斷了舒巴坦介導的這種神經(jīng)保護作用,鏡下可見海馬CA1區(qū)分布著大量死亡的神經(jīng)細胞碎片及不規(guī)則形狀的殘存細胞,細胞核深染,核仁消失;與舒巴坦+缺血組相比,HG明顯增高(Ⅱ-Ⅲ級)(P0.05),ND明顯減低52.2±6.61(P0.05)。單獨應用SB203580(SB203580+sham組)未造成大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元的明顯改變,與sham組相比,其HG(0-Ⅰ)和ND(200.2±6.38)沒有明顯的改變(P0.05)。上述結(jié)果提示,舒巴坦預處理在缺血再灌注過程中有效發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用,p38 MAPK通路特異性抑制劑SB203580可以阻斷舒巴坦介導的這種保護作用。結(jié)論:1舒巴坦預處理可以上調(diào)正常和全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表達,且GLT-1的表達上調(diào)遲于p-p38 MAPK的表達上調(diào)。2應用SB203580抑制p38 MAPK信號通路阻斷了舒巴坦引起的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白上調(diào)。3應用SB203580抑制p38 MAPK信號通路阻斷了舒巴坦誘導的海馬錐體神經(jīng)元的缺血耐受。4以上表明,舒巴坦預處理可通過p38 MAPK通路介導GLT-1表達上調(diào)參與誘導大鼠腦缺血耐受。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號：1255415