本文關(guān)鍵詞：Nrf2缺失加劇DOX引起的心臟毒性和心功能障礙

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【摘要】：背景抗癌藥多柔比星(DOX,也稱阿霉素)是治療大部分癌癥的有效藥物。但是,由于它引起的劑量相關(guān)性急性和慢性心肌毒性極大地限制了化療用量。DOX引起的心肌毒性是多因素的,包括自由基引起的線粒體損傷、DNA損傷、抑制DNA和蛋白合成以及心肌纖維變性,這多種因素導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡和/或壞死。不過,其中的具體病理生理機(jī)制仍不完全明確。這其中占主導(dǎo)地位的假說是,氧化應(yīng)激是DOX誘發(fā)的心肌疾病的主要原因。但是,治療DOX相關(guān)的心肌病,非選擇性清除活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的抗氧化藥物是無效的。所以,更有效的治療手段需要針對氧化應(yīng)激來源或者內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)更加特異的靶點；但是,這類特異性靶點仍待進(jìn)一步研究。NF-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2, Nrf2)是一類轉(zhuǎn)錄因子,它調(diào)控基礎(chǔ)以及誘導(dǎo)的抗氧化基因和細(xì)胞保護(hù)性Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。研究已經(jīng)證明Nrf2在心功能衰竭和病理性重塑過程中,是氧化應(yīng)激的負(fù)調(diào)控因子；同時,也有文獻(xiàn)報道Nrf2在硫化氫介導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的心功能衰竭中具有調(diào)節(jié)作用。因此,Nrf2可能是治療心肌細(xì)胞損傷和心衰的藥物靶點。有意思的是,最近有報道表明Nrf2能增加自噬清除因ROS而產(chǎn)生的毒性泛素化蛋白聚集體的能力,以此證明Nrf2能發(fā)揮激活有效自噬的調(diào)節(jié)作用。因此目前的研究,我們探討了心臟中Nrf2主要通過氧化應(yīng)激和自噬活性調(diào)節(jié)DOX誘發(fā)心肌疾病的作用。Nrf2功能的缺失會加重DOX引起的氧化應(yīng)激、自噬活性缺陷以及心肌細(xì)胞壞死,從而引起心功能衰竭。這些結(jié)果說明Nrf2在DOX心肌疾病中是關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子,從而為發(fā)現(xiàn)治療DOX心肌疾病的新的治療靶點提供理論依據(jù)。目的1.探討在心臟中Nrf2主要通過氧化應(yīng)激和自噬活性調(diào)節(jié)DOX心肌疾病的作用。2.Nrf2是DOX引起的心肌疾病中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子,從而發(fā)現(xiàn)了一類可能治療DOX引起的心肌疾病的新的治療靶點。方法1.構(gòu)建Nrf2敲除小鼠。2.建立阿霉素心肌疾病模型。3.超聲檢測阿霉素心肌疾病小鼠的心功能情況。4.測定體內(nèi)自噬流。5.組織免疫學(xué)檢測氧化應(yīng)激標(biāo)志物和Nrf2表達(dá)。6.Evans藍(lán)標(biāo)記壞死心肌組織。7.制備Nrf2過表達(dá)和敲除以及Atg5過表達(dá)腺病毒。8.新生大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)和腺病毒感染。9. Western Blot檢測蛋白表達(dá)。10.實時定量PCR (Q-PCR)檢測基因表達(dá)。11.應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析,P0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.DOX引起心臟氧化應(yīng)激、心臟毒性和心功能衰竭。單次腹腔注射DOX (25mg/kg)后,心臟中氧化應(yīng)激在第1天開始出現(xiàn)并維持到第4天,呈時間依賴性。同時,心臟中會出現(xiàn)大量的心肌細(xì)胞壞死,以心肌細(xì)胞的胞漿空泡化和散在的Evan藍(lán)染色為標(biāo)志。 此外,DOX刺激4天引起收縮期左心室后壁厚度(LVPW;s)減少、收縮期和舒張期的左心室容積和FS%降低。2.DOX引起心臟中自噬受損和泛素化蛋白聚集。正常心臟中,給予抑制自噬小體與溶酶體融合的氯喹(chloroquine, CQ),會引起心肌中LC3-Ⅱ和p62蛋白的增加,自噬流(autophagic flux)出現(xiàn),說明自噬活性是正常的。雖然DOX刺激后會引起小鼠心肌中LC3-Ⅱ和p62蛋白的增加,但給予CQ卻對它們沒有影響,說明DOX使自噬流受損。此外,DOX還會引起心臟中泛素化蛋白呈時間依賴性聚集。3.DOX引起心臟中Nrf2激活。DOX促進(jìn)了心臟中Nrf2 mRNA水平的表達(dá),呈時間依賴性。DOX刺激4天后,心肌中Nrf2蛋白水平的表達(dá)也是增加的,并引起了Nrf2的核轉(zhuǎn)位。此外,DOX使Nrf2的下游抗氧化表達(dá)基因NQO1和HO-1 mRNA水平增加。4.Nrf2缺失加劇了DOX引起的心肌氧化應(yīng)激和自噬損傷,以及心臟毒性和功能障礙。在心臟可溶性和不可溶性成分中,Nrf2缺失增加DOX上調(diào)的LC3-Ⅱ和p62蛋白,說明Nrf2負(fù)調(diào)控DOX損傷的自噬流。Nrf2缺失并不影響可溶性成分中DOX引起的泛素化蛋白聚集,但增加不可溶性成分中泛素化蛋白的聚集。5.Nrf2活化通過促進(jìn)自噬清除泛素化蛋白聚集體,從而改善DOX引起的心肌細(xì)胞中自噬受損和細(xì)胞死亡。DOX毒性劑量為1μM時,LC3-Ⅱ的水平增加；但使用自噬小體與溶酶體融合的抑制劑BafA1刺激,并不進(jìn)一步使DOX上調(diào)的LC3蛋白累積。此外,DOX(1μM)刺激使細(xì)胞中不可溶性成分中的泛素化蛋白聚集。Nrf2過表達(dá)上調(diào)而Nrf2敲掉下調(diào)LC3-Ⅱ的水平。DOX刺激后,Ad-Gfp對照的細(xì)胞中LC3-Ⅱ水平累積,而Ad-Nrf2感染的細(xì)胞沒有變化。相反,DOX使Ad-scramble對照組和Ad-miNrf2感染的細(xì)胞中LC3-Ⅱ水平呈相等程度累積。Nrf2過表達(dá)顯著抑制了DOX引起的泛素化蛋白聚集體蓄積；而Nrf2敲掉增加了基礎(chǔ)和DOX引起的泛素化蛋白聚集體蓄積。結(jié)論1.Nrf2可能是DOX引起的心肌疾病中內(nèi)源性抑制因子。其中的機(jī)制可能是Nrf2能抑制DOX引起的氧化應(yīng)激和自噬損傷。2.在DOX引起的心臟毒性中,Nrf2通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和自噬活性,能為在防止或減輕DOX引起的心臟毒性和心功能障礙中作為新的治療靶點提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.53

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本文編號：1243974