本文關(guān)鍵詞：Honokiol對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：第一部分Honokiol改善大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究目的：探討Honokiol是否對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能障礙具有改善作用；同時(shí),明確Honokiol治療創(chuàng)傷性腦損傷的合適劑量,為其潛在的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法：1.將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組(每組10只)：假手術(shù)組(sham組),顱腦損傷組(TBI組),Honokiol 0.5mg組,Honokiol 1.0mg組,Honokiol 2.0mg組。sham組大鼠僅僅模擬假性顱腦損傷,其余各組采用TBI-0310顱腦損傷儀制作標(biāo)準(zhǔn)的CCI中度顱腦損傷模型；對(duì)于sham組和TBI組,在創(chuàng)傷后第一天的第8h和16h經(jīng)尾靜脈給予相同容量的Vehicle(供溶解Honokiol用),之后每天一次在早晨8時(shí)給予相同容量的Vehicle,共計(jì)給藥5天,而各Honokiol組則按前述給藥方式給予相應(yīng)劑量的Honokiol。并在TBI后第1、3、7、14、21天采用mNSS評(píng)分法對(duì)各組大鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能缺失情況進(jìn)行評(píng)估△。2.取30只SD大鼠隨機(jī)分為5組(每組6只),分組和處理方式同上,但是,對(duì)于各劑量Honokiol組,僅在傷后的第一天的第8h和16h給藥兩次,各組大鼠在腦損傷后24h獲取腦組織,采用干濕重法測(cè)定腦組織含水量。3.取30只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組10只)：sham組,TBI組,Honokiol 1.Omg組(簡(jiǎn)稱Honokiol組,根據(jù)量效關(guān)系確定的合適劑量),造模和給藥方案同方法1。并分別于1、3、7、14、21天進(jìn)行Beam WalK Test試驗(yàn),15、16、17、18、19天進(jìn)行Morris Water Maze (MWM水迷宮)試驗(yàn)。結(jié)果：1. mNSS評(píng)分結(jié)果顯示,與Sham組比較,TBI造成明顯的神經(jīng)功能缺失。給予Honokiol治療后第一天,各劑量組不能減輕其神經(jīng)功能缺失程度。與TBI+Vehicle組比,Honokiol 0.5mg組在3、7、14天能減輕神經(jīng)功能缺失,Honokiol 1.Omg組在3、7、14、21天均能減輕TBI大鼠的神經(jīng)功能缺失,而Honokiol 2.0mg組在3、7、21天能減輕TBI大鼠的神經(jīng)功能缺失。各劑量組之間比較,Honokiol 1.0mg組與Honokiol 0.5mg組和Honokiol 2.0mg比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,顯示更好的神經(jīng)功能保護(hù)作用。2.與Sham組比較,TBI導(dǎo)致腦含水量明顯增加,而給予Honokiol治療,各劑量組均能減輕腦含水量。但是,Honokiol 1.Omg組與Honokiol 0.5mg組和Honokiol 2.0mg組比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,顯示更好的減輕腦水腫作用。3. Beam WalK Test結(jié)果顯示,與Sham組比較,TBI造成明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙,而給予Honokiol治療,能明顯改善其運(yùn)動(dòng)功能障礙。與TBI+Vehicle組比較,Honokiol在3、7、14、21天能減輕TBI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙。Morris Water Maze試驗(yàn)顯示,與Sham組比較,在Spatial learning測(cè)試中,TBI導(dǎo)致明顯的空間學(xué)習(xí)功能障礙,而給予Honokiol治療,能明顯改善其學(xué)習(xí)功能障礙。與TBI+Vehicle組比較,Honokiol在16、17、18天能減輕TBI大鼠的空間學(xué)習(xí)功能障礙；而在Probe trial測(cè)試中,TBI造成明顯的參考記憶功能障礙,與TBI+Vehicle組比,給予Honokiol治療,能明顯改善其記憶功能障礙。結(jié)論：Honokiol能減輕TBI后大鼠神經(jīng)功能缺失和腦水腫,而且,1.Omg/kg的Honokiol為本次試驗(yàn)中合適的治療劑量,同時(shí),Honokiol能改善TBI后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能障礙。第二部分Honokiol減輕大鼠顱腦創(chuàng)傷后的病理?yè)p害及抑制神經(jīng)元凋亡的實(shí)驗(yàn)研究目的：觀察Honokiol對(duì)顱腦創(chuàng)傷后腦組織病理?yè)p害及神經(jīng)元變性凋亡的影響,探討其對(duì)腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用。方法：1.取30只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組10只)：sham組,TBI組,Honokiol 1.Omg組,sham組大鼠僅模擬假性顱腦損傷,其余各組采用TBI-0310顱腦損傷儀制作標(biāo)準(zhǔn)的CCI中度顱腦損傷模型。對(duì)于sham組和TBI組,在創(chuàng)傷后第一天的第8h和16h經(jīng)尾靜脈給予相同容量的Vehicl,之后每天一次在早晨8時(shí)給予相同容量的Vehicle,共計(jì)給藥5天。而Honokiol組則按前述給藥方式給予相應(yīng)劑量的Honokiol。在傷后/假手術(shù)后第21天獲取腦組織標(biāo)本,采用H-E染色法對(duì)腦損傷體積進(jìn)行評(píng)估。2.取30只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組10只)：分組和造模及給藥方案同前,在傷后/假手術(shù)后第21天獲取腦組織標(biāo)本,采用Nissl染色法對(duì)皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失情況進(jìn)行評(píng)估。3.取24只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：分組和造模同前,但對(duì)于Honokiol組,僅在傷后第一天的第8h和16h給藥兩次,在腦創(chuàng)傷/假手術(shù)后24h獲取腦組織標(biāo)本,采用FJ-B標(biāo)記法對(duì)皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性情況進(jìn)行評(píng)估。4.取24只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：分組和造模同前,但對(duì)于Honokiol組,在傷后第一天的第8h和16h給藥兩次,隨后每日給藥一次,共計(jì)給藥3天,在傷后/假手術(shù)后第3天獲取腦組織標(biāo)本,采用NeuN+Tunel免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)對(duì)皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果：1.與TBI+Vehicle組(36.79+1.13 mm3)比較,大鼠TBI給予Honokiol治療(21.37±1.01 mm3),能明顯減輕TBI造成的腦組織缺損(P0.05)：線性回歸分析提示,其減輕腦組織缺損與在Beam Walk Test測(cè)試中改善其運(yùn)動(dòng)功能具有高度相關(guān)性(r2=0.93；P0.0001)。2.TBI造成大鼠皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍(62.84±4.22 vs 206.39±1.91 in sham組)和海馬CA1區(qū)(76.19±4.21 vs 185.97±1.88 in sham組)明顯的神經(jīng)元缺失,與TBI+Vehicle組比,大鼠TBI后給予Honokiol治療,能明顯減輕TBI造成的皮質(zhì)(145.14±2.59)和海馬CA1區(qū)(136.76±2.53)神經(jīng)元丟失；線性回歸分析提示,其增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活與在Morris Water Maze實(shí)驗(yàn)中改善其學(xué)習(xí)功能具有高度相關(guān)性(r2=0.94；P0.0001)。3.TBI造成大鼠皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍(110.70-4.72)和海馬CA1區(qū)(134.95±8.63)明顯的神經(jīng)元變性,與TBI+Vehicle組比,大鼠TBI后給予Honokiol治療,能明顯減輕TBI造成的皮質(zhì)(33.28±1.88)和海馬CA1區(qū)(59.74±6.50)神經(jīng)元變性(P0.05)。4.TBI誘發(fā)大鼠皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍(37.13±1.94%)和海馬CA1區(qū)(60.01±3.18%)明顯的神經(jīng)元凋亡,與TBI+Vehicle組比,大鼠TBI后給予Honokiol治療,能明顯減輕TBI造成的皮質(zhì)(12.11±1.16%)和海馬CA1區(qū)(19.12±1.67%)神經(jīng)元凋亡。結(jié)論：Honokiol能顯著減輕TBI后大鼠腦損傷體積,增加皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬神經(jīng)元存活數(shù)；Honokiol也能明顯減少皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬神經(jīng)元的變性和凋亡；Honokiol對(duì)神經(jīng)元的這種保護(hù)作用有利于改善顱腦損傷后大鼠的神經(jīng)功能障礙。第三部分Honokiol對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元細(xì)胞周期活化的影響目的：觀察大鼠顱腦損傷后細(xì)胞周期的活化情況以及Honokiol對(duì)大鼠顱腦損傷后神經(jīng)元細(xì)胞周期活化的影響,探討Honokiol抑制大鼠顱腦損傷后神經(jīng)元凋亡的潛在機(jī)制。方法：1.對(duì)于每個(gè)待研究的細(xì)胞周期蛋白,取12只SD大鼠隨機(jī)分為2組(每組6只)：sham組和TBI組,sham組大鼠僅模擬假性顱腦損傷,TBI組造模同前,在第1、3、7、14、21天獲取腦組織標(biāo)本,采用Western-Blot法測(cè)定顱腦損傷/假手術(shù)后腦組織周期蛋白的表達(dá)情況。2.對(duì)于每個(gè)待研究的細(xì)胞周期蛋白,取18只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組6只)：sham組,TBI+Vehicle組,Honokiol 1.Omg組,造模和給藥方式第二部分,根據(jù)上述研究得出的細(xì)胞周期蛋白表達(dá)變化的峰值時(shí)間點(diǎn)決定給藥總時(shí)間,第一天為兩次(間隔時(shí)間同前),之后為每日一次,最多給藥5天；在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)獲取腦組織標(biāo)本,采用Western-Blot法觀察Honokiol對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。3.取24只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：分組和造模同前。對(duì)于Honokiol組,在傷后給藥3天(方式同前),在顱腦損傷/假手術(shù)后3天獲取腦組織標(biāo)本,采用免疫熒光雙標(biāo)法觀察Honokiol對(duì)腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和E2F1表達(dá)的影響及細(xì)胞周期蛋白與神經(jīng)元凋亡關(guān)系的影響。結(jié)果：1.顱腦損傷后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1, CDK4, pRb(Ser780)和E2F1表達(dá)升高,而p27表達(dá)降低,Cyclin D1和E2F1在第3天達(dá)峰值,pRb (Ser780)在第1天達(dá)峰值,CDK4在傷后進(jìn)行性升高直達(dá)21天,p27則在傷后第3天降到最低值,直到第21天仍未完全恢復(fù)。2.顱腦損傷后給予Honokiol治療,能顯著降低腦損傷后細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1, CDK4, pRb(Ser780)和E2F1的活化程度,同時(shí)也能升高內(nèi)源性細(xì)胞周期抑制性蛋白p27的表達(dá)。3.顱腦損傷后神經(jīng)元出現(xiàn)Cyclin D1和E2F1的表達(dá)升高,同時(shí)大部分表達(dá)這些細(xì)胞周期蛋白的神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡,而這些異常改變?cè)诮o予Honokiol治療后,被明顯抑制。結(jié)論：顱腦損傷后出現(xiàn)細(xì)胞周期的異常激活與顱腦損傷后神經(jīng)元的凋亡及神經(jīng)功能障礙有關(guān),而Honokiol治療能抑制大鼠顱腦損傷后神經(jīng)元細(xì)胞周期的異常激活和因此而導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡,可能是其改善大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能障礙的潛在機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.15

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本文編號(hào)：1241753