本文關鍵詞：解郁育胞方對慢性應激大鼠子宮內膜容受性影響的實驗研究

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【摘要】：目的:本課題通過實驗研究解郁育胞方對慢性應激大鼠子宮內膜容受性的干預作用,并探討其作用機理。旨在探索臨床不孕患者因生活環(huán)境、不孕本身、或由試管嬰兒(IVF-ET)失敗等造成心理壓力引起子宮內膜容受性低下的機理,為臨床應用疏肝養(yǎng)肝法治療不孕證及輔助生殖技術(ART)的中醫(yī)輔助治療,從而提高受孕成功率,提供理論依據(jù)。方法:本研究以SPF級Sprague-Dawley(SD)系大鼠為研究對象,通過建立慢性應激模型,采用解郁育胞方對子宮內膜容受性進行實驗研究。選擇有正常動情周期的8周齡SD雌性大鼠納入實驗,進入SPF級屏障系統(tǒng)動物實驗室,按體重分層法隨機分為5組,每組16只。包括A組正常對照組(A正常組),B組模型對照組(B模型組),C組解郁育胞方低劑量組(C解低組),D組解郁育胞方中劑量組(D解中組),E組解郁育胞方高劑量組(E解高組)。除A正常組外,其余4組大鼠采用慢性輕度不可預見性應激模型造模,接受14日不同應激源刺激,包括行動受限(2h)、夾尾(1min,3次/日)、冰水游泳(4℃,5min)、噪音(75d B,1h)、禁食(24h)、禁水(24h)、電擊足底(電壓50m V,每隔50s刺激1次,每次持續(xù)10s,共30次)。每日隨機選擇2種刺激。造模14日后大鼠出現(xiàn)倦怠懶動,進食興趣降低,修飾行為(抬舉、抓癢、舔足等)減少,提示造模成功。各組持續(xù)刺激至合籠日,共28日。D解中組:于刺激第15日開始,每日9:00給予解郁育胞方溶液(相當于生藥1g·m L-1)灌胃,按體表面積折算臨床有效劑量,給藥容量為11.2m L·kg-1,每日1次,至處死日。C解低組:于刺激第15日開始,每日9:00給予解郁育胞方溶液灌胃,按D解中組所折算臨床有效劑量的1/2給藥,給藥容量為5.6m L·kg-1,每日1次,至處死日。E解高組:于刺激第15日開始,每日9:00給予解郁育胞方溶液灌胃,按D解中組折算臨床有效劑量的2倍給藥,給藥容量為22.4m L·kg-1,每日1次,至處死日。A正常組、B模型組于第15日每日9:00灌服臨床有效劑量等體積蒸餾水,容量為11.2m L·kg-1,每日1次,直至處死日。五組大鼠分別于第28日16:00雌雄2:1合籠,次日晨9:00時檢查陰栓,并進行陰道涂片檢查,涂片發(fā)現(xiàn)精子或陰栓者記為妊娠第1日。各組達到妊娠第4日(處死日)的8只大鼠,于當日16:00摘眼球取血3-5m L,30min內于1000*g離心15min,取上清液,按使用說明書檢測β-內啡肽(β-EP)含量。取血結束后采用頸椎脫臼法處死大鼠,剖取并分離子宮,將子宮內膜沿縱軸剖開,展平,反復用生理鹽水沖洗后,取單側子宮放入4%戊二醛固定,石蠟包埋,切片,HE染色,制成透射電鏡標本,觀察子宮內膜胞飲突。取另側子宮分切成上、下2段,上段置于10%多聚甲醛中固定,運用免疫組化SP法,檢測各組大鼠子宮內膜血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平;下段子宮取出后立即置于-80℃冰箱保存,實時熒光定量聚合酶鏈技術(Real-Time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)測HOXA-10m RNA含量。各組剩余8只大鼠于合籠第10日16:00全部頸椎脫臼法處死,剖取子宮,統(tǒng)計妊娠率和平均胚胎數(shù)。結果:1.各組大鼠一般情況觀察造模14日后,B模型組和C解低組大鼠出現(xiàn)神態(tài)倦怠,眼目無神,扎堆懶動,造模時抗爭不積極,修飾行為(抬舉、抓癢、舔足等)減少,攝食量減少,大便性狀改變(干結或稀溏),毛色無光澤等表現(xiàn)。說明應激對大鼠情緒和行為造成了一定的影響。A正常組、D解中組、E解高組毛色光潔整齊,活潑好動,眼睛有神,攝食正常,體重上升較迅速。直至實驗結束,各組大鼠用藥期間均未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應,應激結束后各組大鼠無死亡。2.各組大鼠動情周期變化于造模第15日進行陰道涂片,連續(xù)觀察大鼠動情周期變化14日。B模型組表現(xiàn)為動情周期延長,主要為動情間期延長,顯微鏡下觀察大量白細胞、少量有核退化上皮細胞和黏液出現(xiàn)的時間延長。B模型組和C解低組的動情周期比A正常組明顯延長(P0.05)。D解中組、E解高組與B模型組相比,動情周期縮短(P0.05);與A正常組相比無明顯差異(P0.05)。C解低組與E解高組、D解中組相比,動情周期有明顯差異(P0.05)。3.各組大鼠血清β-EP比較B模型組大鼠血清β-EP的含量比A正常對照組明顯增加(P0.05),證明造模成功;與A正常組比較,C解低組的β-EP含量明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P0.05);而D解中組、E解高組與A正常組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與B模型組比較,解郁育胞方各實驗組(低、中、高三組)的β-EP含量均低于B模型組,均高于A正常組,D解中組、E解高組與B模型組比較有顯著差異(P0.05),而C解低組與B模型組比較β-EP含量無明顯差異(P0.05);D解中組、E解高組的β-EP含量明顯低于C解低組(P0.05)。D解中組、E解高組之間無明顯差異(P0.05)。4.透射電鏡下各組大鼠子宮內膜上皮細胞胞飲突表達與A正常對照組相比,B模型組、C解低組、D解中組的胞飲突評分下降,其中B模型組、C解低組與A正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),D解中組與A正常組無明顯差異(P0.05);而E解高組胞飲突評分比A正常組略高,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與B模型組相比,解郁育胞方各實驗組(低、中、高三組)胞飲突評分均較B模型組增高,D解中組、E解高組的胞飲突評分明顯高于B模型組(P0.05);D解中組、E解高組的胞飲突評分明顯高于C解低組(P0.05);D解中組、E解高組之間無明顯差異(P0.05)。5.各組大鼠子宮內膜HOXA-10m RNA的表達子宮內膜HOXA-10m RNA含量通過計算標本HOXA-10m RNA與β-Actin m RNA的比值測定。HOXA-10m RNA在5組子宮內膜和蛻膜組織中均有表達,A正常組值為0.965±0.102,B模型組為0.6583±0.031,C解低組值為0.7983±0.017,D解中組值為0.8663±0.125,E解高組值為0.8246±0.317。HOXA-10m RNA在不同條件下大鼠子宮內膜中的相對含量顯示,與A正常組相比,B模型組和C解低組HOXA-10m RNA的表達水平顯著下降(P0.05)。與B模型組比較,C解低組、D解中組、E解高組的HOXA-10m RNA的表達水平均顯著提高,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與C解低組比較,D解中組、E解高組的HOXA-10m RNA的表達水平無明顯差異(P0.05)。D解中組、E解高組之間HOXA-10m RNA的表達水平無明顯差異(P0.05)。6.各組大鼠子宮內膜VEGF比較VEGF主要表達于子宮內膜腺上皮細胞和部分基質血管內皮細胞的胞漿,部分間質細胞亦呈現(xiàn)弱著色,各試驗組表達強弱不一。與A正常組相比,B模型組VEGF的表達明顯降低(P0.05),說明慢性應激對大鼠的子宮內膜血管生成有抑制作用。解郁育胞方實驗組(低、中、高三組)與正常對照組VEGF的表達相比較差異無顯著統(tǒng)計學意義(P0.05),但與B模型組相比有明顯差異(P0.05)。解郁育胞方實驗組(低、中、高三組)之間VEGF的表達無明顯差異(P0.05)。7.各組大鼠妊娠數(shù)及著床數(shù)比較各組大鼠經(jīng)過10日合籠,A正常組、D解中組、E解高組均全部妊娠,B模型組和C解低組各有1只大鼠仍未妊娠。與A正常組相比,B模型組與C解低組的大鼠平均著床點數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。D解中組和E解高組的平均著床點數(shù)與A正常組無明顯差異(P0.05)。與B模型組相比,D解中組和E解高組的平均著床點數(shù)明顯增高(P0.05);與C解低組相比,D解中組和E解高組的平均著床點數(shù)明顯增高(P0.05);D解中組和E解高組之間的平均著床點數(shù)無明顯差異(P0.05)。結論:1.B模型組大鼠的行為學、動情周期、血β-EP等指標發(fā)生改變,造模成功;2.慢性應激能夠對大鼠子宮內膜容受性的相關指標(VEGF、子宮內膜上皮細胞胞飲突、HOXA-10m RNA的表達)產(chǎn)生影響;3.解郁育胞方能夠改善大鼠的應激狀態(tài)(一般狀態(tài),動情周期,血β-EP等);4.解郁育胞方對應激所造成的子宮內膜容受性指標胞飲突、VEGF、HOXA-10m RNA表達具有改善作用,且呈現(xiàn)劑量依賴性的特點。因此,我們推測解郁育胞方可能通過改善大鼠的應激狀態(tài),改善慢性應激大鼠子宮內膜容受性相關因子的表達,從而改善子宮內膜容受性,進而增加大鼠妊娠率、著床點數(shù)。
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
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本文編號：1196249