本文關(guān)鍵詞：WNK_3對(duì)鈉氯協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)子的調(diào)節(jié)及在胚腎細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用

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【摘要】：水鈉潴留是高血壓發(fā)病機(jī)制中的核心環(huán)節(jié)之一,腎臟對(duì)鈉離子的重吸收程度與體內(nèi)細(xì)胞外液及血壓息息相關(guān)。腎小管是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈉離子水平的關(guān)鍵部位,其鈉轉(zhuǎn)運(yùn)通道的異�？芍苯右鹚c潴留。在過(guò)去的50年里,噻嗪類(lèi)利尿劑常常被推薦為高血壓臨床一線藥物,但開(kāi)發(fā)這些藥物的時(shí)候,高血壓發(fā)病機(jī)理還不是十分明確。部分高血壓病人療效不佳可能與人們對(duì)鈉排泄機(jī)制的理解不充分有關(guān),近期研究發(fā)現(xiàn)噻嗪類(lèi)利尿劑實(shí)際上是鈉氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子(thiazide-sensitive Na-Clcotransporter [NCC]; SLC12A3)的特異性抑制劑。因此,探索鈉氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子作用機(jī)理及調(diào)控途徑對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥及開(kāi)發(fā)新的降壓藥具有積極的意義。WNK激酶(With No Lysine Kinase)是近期高血壓研究的一個(gè)新方向。WNK由于其在Ⅱ號(hào)亞區(qū)缺乏一個(gè)高度保守的起催化作用的賴(lài)氨酸而得名,包含四個(gè)家族成員WNK1～4、WNK1能通過(guò)MEKK2/3來(lái)磷酸化ERK5,WNK3激酶也可磷酸化SPAK (STE20/SPS1相關(guān)的富含脯氨酸/丙氨酸的激酶)。WNN4能直接抑制NCC活性,但WNK 1抑制WNN4效應(yīng),而KS-WNK1(腎臟特有的WNK1)抑制全長(zhǎng)的WNK1,在體內(nèi)形成相互牽制的動(dòng)態(tài)平衡,共同調(diào)節(jié)NCC等離子通道。若WNK激酶家族的兩個(gè)成員WNK1和WNK4的突變能導(dǎo)致一種遺傳性高血壓——假性醛固酮減少癥Ⅱ型(Pseudohypoaldosteronism Ⅱ,PHA Ⅱ)。最近的研究表明WNK3也是調(diào)節(jié)NCC的重要成員之一,但WNK3的功能發(fā)揮與WNK4、WNK1密切相關(guān),WNK3可拮抗WNK4的活性,反之亦然。KS-WNK1可抑制WNK3酶活性,Rinehart等報(bào)道在爪蟾卵母細(xì)胞中,采用放射性標(biāo)記跟蹤法(22Na流研究)發(fā)現(xiàn)：野生型WNK3 (WNK3-WT)可增強(qiáng)NCC的表達(dá),無(wú)激酶活性的WNK3則對(duì)NCC起抑制作用。致PHAⅡ突變體WNK3對(duì)NCC的作用與WNK3-WT表現(xiàn)相似,提示W(wǎng)NK3激酶在調(diào)節(jié)血壓和維持電解質(zhì)平衡中代表了一種新的信號(hào)途徑。我們構(gòu)建了帶有各種標(biāo)記的WNK3和NCC質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染腎小管細(xì)胞,觀察WNK3與NCC在細(xì)胞上的分布和相互作用,并探索其可能調(diào)控機(jī)制和ERK通路的關(guān)系,將對(duì)闡明高血壓的發(fā)病機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的噻嗪類(lèi)利尿劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,有助于設(shè)計(jì)新的高血壓治療方案,為高血壓患者提供更多的副作用較少的治療藥物,從而改善高血壓患者的健康。WNK3在體內(nèi)參與細(xì)胞骨架形成,細(xì)胞凋亡及腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3-KD(酶區(qū)域缺陷WNK3)質(zhì)粒,在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)皺縮,表明WNK3-KD不能維持細(xì)胞正常形態(tài),還發(fā)現(xiàn)WNK1, WNK3維持細(xì)胞存活的功能在細(xì)胞面臨代謝紊亂(乳酸酸中毒及細(xì)胞體積變化)時(shí)表現(xiàn)的更加顯著。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-WNK3質(zhì)粒的HeLa(子宮頸癌細(xì)胞),在actinomycin-D誘導(dǎo)凋亡處理下的存活時(shí)間顯著長(zhǎng)于沒(méi)有轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-WNK3質(zhì)粒的HeLa,表明WNK3通過(guò)caspase-3依賴(lài)途徑延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間,延緩細(xì)胞凋亡。腎臟是維持水和電解質(zhì)平衡的重要臟器,但也極易受到缺血缺氧、藥物等各種因素引起的損傷,進(jìn)而引起腎臟不同細(xì)胞的功能受損,甚至細(xì)胞凋亡或壞死。已有研究顯示W(wǎng)NK3具有其他三個(gè)家族成員中不一樣的特性,例如對(duì)細(xì)胞的凋亡有一定的保護(hù)作用,如子宮頸癌細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞元等,其機(jī)制還不十分明確。但對(duì)人腎臟細(xì)胞的凋亡有無(wú)保護(hù)作用暫無(wú)相關(guān)報(bào)道,故而本課題還針對(duì)WNK3高表達(dá)對(duì)白介素-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡有無(wú)保護(hù)作用。我們研究結(jié)果表明WNK3具有保護(hù)腎臟細(xì)胞在不利條件下的生存能力,故建議在調(diào)控過(guò)程中避免過(guò)度抑制WNK3,以免影響腎臟細(xì)胞生存能力。第一部分 WNK3和NCC質(zhì)粒的構(gòu)建目的：構(gòu)建帶有HA、GFP、Myc各種標(biāo)記的WNK3和NCC質(zhì)粒。方法：應(yīng)用試劑盒提取人全血DNA,采用50u1反應(yīng)體系,應(yīng)用設(shè)計(jì)好的WNK3引物,提取以人DNA為模板WNK3片段,PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并回收純化。選擇EcoRI和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn),打開(kāi)空白質(zhì)粒環(huán),作為WNK3接入點(diǎn),將WNK3激酶和pCMV-HA Vector(帶HA標(biāo)記的空載體)各50ul體系,在PCR儀中設(shè)定37℃,運(yùn)行四小時(shí)同時(shí)進(jìn)行酶切,使兩者可以形成互補(bǔ)片段。采用含T4 DNA ligase的20 ul體系在PCR儀器設(shè)置16℃過(guò)夜,連接WNK3片段和pCMV-HA Vector,制備感受態(tài)大腸桿菌,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌,加入SOC培養(yǎng)液,37℃ 225～250 rpm振蕩培養(yǎng)至混濁,接種到培養(yǎng)皿上,挑選單克隆菌落,重新在大腸桿菌中擴(kuò)增,使用QIAGEN Plasmid mini Kit提取質(zhì)粒,將獲得的重組質(zhì)粒分成兩份,一份進(jìn)行EcoRI和Xho Ⅰ酶鑒定,酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定,并回收純化。收集片段送Agencourt Bioscience Corporation測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank中人WNK3基因序列進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序正確的序號(hào)對(duì)應(yīng)單克隆質(zhì)粒即我們的目標(biāo)質(zhì)粒pCMV-HA-WNK3質(zhì)粒,供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。類(lèi)似方法合成pCMV-Myc-WNK3、PCMV-HA-NCC、pEGFP-N1-NCC等系列質(zhì)粒。并將其轉(zhuǎn)染胚腎細(xì)胞HEK293和腎小管Cos-7細(xì)胞,觀察其熒光及蛋白表達(dá)。結(jié)果：1)基因測(cè)序均正確；2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后免疫熒光觀察及后續(xù)實(shí)驗(yàn)提示質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)良好。結(jié)論：我們利用基因工程成功構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)所需的質(zhì)粒,酶切鑒定及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)均符合實(shí)驗(yàn)要求。第二部分 WNK3和NCC在Cos-7細(xì)胞上的分布及相互作用目的：觀察WNK3、NCC在Cos-7細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上的分布,WNK3對(duì)NCC蛋白表達(dá)的劑量效應(yīng),兩者有無(wú)直接相互作用。方法：1)Cos-7細(xì)胞分2組,分別轉(zhuǎn)染pEGFP-NCC+ pCMV-HA-Vector(作為對(duì)照)和pEGFP-NCC+ pCMV-HA-WNK3,培養(yǎng)36小時(shí)后加抗HA熒光二抗,在免疫熒光顯微鏡下檢測(cè)兩種蛋白分布。2)Cos-7細(xì)胞分3組,放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱內(nèi),24小時(shí)內(nèi)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度在40-50%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染,每組中加入恒定量的HA-NCC(0.5μg/盤(pán)),HA-WNK3則按計(jì)量遞增轉(zhuǎn)染(分別為0.5μg、1μg、2μg/盤(pán)),其中單獨(dú)轉(zhuǎn)染NCC作為對(duì)照組,培養(yǎng)36小時(shí)細(xì)胞裂解后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后用多克隆兔抗HA抗體檢測(cè)WNK3和NCC,用多克隆兔抗GAPDH抗體檢測(cè)GAPDH,觀察WNK3對(duì)NCC總蛋白水平的調(diào)節(jié)作用。3)轉(zhuǎn)染前一天細(xì)胞分離傳代,在2個(gè)10 cm培養(yǎng)皿接種Cos-7細(xì)胞,放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱內(nèi),24小時(shí)內(nèi)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度在30-40%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。Cos-7細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP-NCC或同時(shí)轉(zhuǎn)染HA-WNK3,使用anti-HA及壁珠收集WNK3蛋白,血清作為對(duì)照。洗脫后跑蛋白印跡檢測(cè)NCC,觀察WNK3對(duì)NCC蛋白有無(wú)直接調(diào)節(jié)作用。結(jié)果：1)免疫共聚焦顯微鏡可以觀察到WNK3主要分布在Cos-7的細(xì)胞漿,而NCC分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,結(jié)果提示轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3后,NCC在胞漿和包膜的表達(dá)量顯著增強(qiáng)。2)WNK3、NCC轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞,免疫印跡結(jié)果顯示：隨著WNK3劑量的增加,NCC的表達(dá)水平顯著提高。3)Cos-7細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP-NCC或同時(shí)轉(zhuǎn)染HA-WNK3,抗HA抗體可以使HA-WNK3免疫沉淀NCC,但未轉(zhuǎn)染HA-WNK3或血清作為一抗卻沒(méi)法使免疫沉淀NCC,提示W(wǎng)NK3和NCC可以直接相互作用。結(jié)論：WNK3主要分布在Cos-7的細(xì)胞漿,而NCC分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。WNK3高表達(dá)可增強(qiáng)Cos-7細(xì)胞NCC表達(dá)量。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)提示兩者有直接相互作用的可能性。第三部分WNK3對(duì)NCC蛋白合成和降解過(guò)程的影響目的：WNK3激酶是否通過(guò)影響NCC蛋白合成或降解途徑而增加NCC表達(dá)量。方法：1)Cos-7細(xì)胞分2組,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)豐度達(dá)到30-40%時(shí)分別轉(zhuǎn)染NCC和NCC+WNK3,培養(yǎng)48小時(shí)后兩組細(xì)胞均換成含有100ug/ml CHX(Cycloheximide from microbial)的培養(yǎng)液。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)0、1、2、4、6、8小時(shí)收集并裂解細(xì)胞,配制樣品蛋白。進(jìn)行相關(guān)蛋白測(cè)定。2)Cos-7細(xì)胞分4組,向每組中轉(zhuǎn)染恒定劑量的NCC(0.5μg/組),向第2、4中轉(zhuǎn)染相同劑量的WNK3(1μgg/組)。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后,第3、4加入質(zhì)子泵抑制劑Baf A1 (Baflomycine A1)阻斷溶酶體降解通路,1、2組中加入等量的DMSO。Baf A1的使用終濃度均為0.5μmol/L。12小時(shí)后裂解細(xì)胞,配制樣品蛋白檢測(cè)NCC表達(dá)量的變化。結(jié)果：1)單獨(dú)轉(zhuǎn)染NCC的Cos-7細(xì)胞,NCC蛋白表達(dá)在CHX作用2小時(shí)后顯著降低,而WNK3+NCC組在CHX作用6小時(shí)后.NCC才開(kāi)始顯著減少。2)在第1,2組中,相對(duì)單獨(dú)轉(zhuǎn)染NCC組(第1組),WNK3激酶顯著增加了NCC蛋白表達(dá)(第2組),增加幅度達(dá)2倍(p0.05,n=4)。含有0.5 μM Baf A1培養(yǎng)液預(yù)處理Cos-7細(xì)胞后,單獨(dú)轉(zhuǎn)染NCC組(第3組)相對(duì)未經(jīng)Baf Al預(yù)處理的NCC組(第1組),NCC蛋白表達(dá)增加了50%(p0.05,n=4)。但Baf A1預(yù)處理的WNK3+NCC組(第4組),較沒(méi)有Baf A1預(yù)處理的WNK3+NCC組(第2組)NCC上升不顯著,提示W(wǎng)NK3可能通過(guò)減少NCC溶酶體途徑降解,從而增加NCC表達(dá)量。結(jié)論：WNK3激酶增加NCC蛋白表達(dá)可能通過(guò)減少NCC溶酶體降解途徑調(diào)控NCC,而與蛋白合成途徑無(wú)顯著相關(guān)。第四部分ERK通路在WNK3調(diào)節(jié)NCC機(jī)制中的作用目的：WNK3增加NCC總蛋白表達(dá)水平是否通過(guò)MAPK ERK1/2細(xì)胞信號(hào)通路。方法：1)Cos-7細(xì)胞傳代接種在6cm培養(yǎng)皿,分3組,每組均轉(zhuǎn)染0.5 μg pCMV-HA-NCC,各組分別轉(zhuǎn)染0、1、3ug pCMV-Myc-WNK3,培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞并裂解。使用anti-HA和anti Myc抗體、t-ERK和pERK抗體檢測(cè)相關(guān)蛋白。2)Cos-7細(xì)胞分4組,第二組轉(zhuǎn)染Scramble siRNA,第四組轉(zhuǎn)染ERK 1/2 siRNA,第二、四組轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3質(zhì)粒,48小時(shí)后檢測(cè)相關(guān)蛋白。用Microchemi化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色條帶,測(cè)量目的及內(nèi)參的灰度值,取其比值作為結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果：1)隨著WNK3劑量的增大,p-ERK1/2的表達(dá)水平也隨之下降,表明WNK3以劑量依賴(lài)的方式抑制p-ERK1/2的表達(dá)。t-ERK1/2為p-ERK1/2的蛋白上樣內(nèi)參,表明ERK1/2的總量沒(méi)有變化。2)過(guò)表達(dá)WNK3可以上顯著增加Cos-7細(xì)胞的NCC表達(dá)量。與未轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。沉默ERK 1/2表達(dá)本身可以增加NCC表達(dá)。但沉默ERK 1/2可抑制WNK3介導(dǎo)的NCC表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：WNK3抑制p-ERK1/2蛋白的表達(dá),且與WNK3呈劑量依賴(lài)關(guān)系,以上正反兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)WNK3通過(guò)MAPK ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)NCC的表達(dá)水平。第五部分WNK3激酶對(duì)白介素-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用目的：觀察WNK3高表達(dá)對(duì)白介素-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡有無(wú)保護(hù)作用。方法：1)轉(zhuǎn)染前一天在6cm培養(yǎng)皿內(nèi)傳代HEK293細(xì)胞(共3組,每組3盤(pán)),細(xì)胞生長(zhǎng)密度在40%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染,第一組和第二組轉(zhuǎn)染1μg PCMV-HA-Vector,第三組轉(zhuǎn)染加入3μgWNK3,轉(zhuǎn)染4h后換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h,細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/每孔的密度接種于96孔板,第二、三組培養(yǎng)液中加入10ng/ml IL-1β(第二組為陽(yáng)性對(duì)照)：第一組培養(yǎng)液加入等量生理鹽水作為陰性對(duì)照。于37℃孵箱中孵育0h、12h、24h和36h時(shí),使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。2)Cos-7細(xì)胞分3組,每組3盤(pán),放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱內(nèi),24小時(shí)內(nèi)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度在40%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染步驟同上,轉(zhuǎn)染4h后換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h,第二、第三組加入10ng/ml IL-1β,第一組加入等量生理鹽水。于孵箱中孵育0h、18h、36h時(shí)收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行檢測(cè)Caspase-3、Cleaved Caspase-3, Caspase-9、Cleaved Caspase-9, Bcl-2、Bax、LC3A/B、Beclin-1等凋亡和自噬相關(guān)蛋白等表達(dá)水平。3)分組及轉(zhuǎn)染方法同上,但在IL-1β(對(duì)照組用等量生理鹽水)干預(yù)Omin、30min、60min離心收集細(xì)胞,檢測(cè)JNK、ERK等通路蛋白。結(jié)果：1)Vector+NS組在等量生理鹽水干預(yù)0小時(shí)至48小時(shí)細(xì)胞活性變化不顯著,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而Vector+IL-1β組在給藥后細(xì)胞活性即開(kāi)始逐漸下降,在24小時(shí)與同組0小時(shí)比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(93.21±3.83VS 77.25±4.60,P0.05),在48小時(shí)達(dá)到最低值(93.21±3.83 VS57.26±6.71,P0.01),WNK3+IL-1β組下降幅度較緩和,在36小時(shí)和48小時(shí)與同組0小時(shí)比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P0.05),但與同時(shí)間點(diǎn)Vector+IL-1β組比較細(xì)胞活性有所回升,在48小時(shí)達(dá)到顯著差異(57.26±6.71 VS 80.35±5.34,P0.01)。2)而Vector+IL-1β組在給藥后18小時(shí)Bcl-2表達(dá)量開(kāi)始逐漸下降,在36小時(shí)與同組0小時(shí)比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；給藥后18小時(shí)Caspase-9和Caspase-3表達(dá)量開(kāi)始逐漸下降,Cleaved Caspase-9增加,在18小時(shí)到達(dá)高峰,36小時(shí)略有下降,同時(shí)在36小時(shí)檢測(cè)到較為顯著的Cleaved Caspase-3。WNK3+IL-1β組Caspase-3下降幅度較緩和,Caspase-9變化不顯著,檢測(cè)到微弱的Cleaved Caspase-9,但變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在36小時(shí)才檢測(cè)到少量CleavedCaspase-3,與同組0小時(shí)比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。WNK3+IL-1β組Bcl-2減少、Bax變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IL-1p誘導(dǎo)細(xì)胞后,Beclin-1和LC3蛋白均有增加,WNK3高表達(dá)可通過(guò)Beclin-1途徑部分逆轉(zhuǎn)自噬蛋白的表達(dá)。3)IL-Iβ可同時(shí)促進(jìn)激活JNK和ERK的磷酸化。WNK3轉(zhuǎn)染后,p-JNK、pERK的表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染3WNK3組的上升幅度降低。結(jié)論：1)IL-1p誘導(dǎo)HEK細(xì)胞活性下降,而轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3可以有效部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞活性。2)WNK3通過(guò)Beclin抑制其過(guò)度自噬,抑制Caspase途徑的活化,減少細(xì)胞凋亡,起到在不利條件下保護(hù)腎臟細(xì)胞的作用。3)WNK3過(guò)表達(dá)可抑制白介素-1β誘發(fā)的JNK和ERK通路的激活與磷酸化。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R544.1
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本文編號(hào)：1178565