本文關(guān)鍵詞：光學分子影像技術(shù)在肝癌動物模型構(gòu)建及診療中的應(yīng)用研究

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【摘要】：研究背景光學分子影像的概念首先由Weissleder于1999年提出(Weissleder R. Molecular imaging:exploring the next frontier[J]. Radiology,1999,212(3):609-14.),是指在分子水平上反映生物體生理、病理變化的特異性成像技術(shù),能夠提供以解剖結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)、以細胞水平為基準的疾病發(fā)生、發(fā)展的信息,故可作為疾病分期診斷的定位、定性、定量的可靠依據(jù)。相對于離體檢測方法,其優(yōu)勢在于可對同一機體實現(xiàn)實時、無創(chuàng)、動態(tài)觀察,同目前其它醫(yī)學影像手段相比具有靈敏度高、易操作、無輻射、投入小等優(yōu)點,由于其可以在細胞水平體現(xiàn)和鑒別活體內(nèi)不同生理、病理過程,相對于之前的影像技術(shù)主要定位在形態(tài)和結(jié)構(gòu)層面上認識疾病過程,分子影像技術(shù)著力于在生物化學和細胞內(nèi)來揭示疾病的發(fā)生發(fā)展過程(Blow N. In vivo molecular imaging:the inside job[J]. Nature Methods,2009,6(6): 465-469.).隨著計算機科學、分子生物學、生物工程學、臨床醫(yī)學等學科的不斷進步和交叉給醫(yī)學提供了大量精確量化的實驗?zāi)Ｐ?大大促進了臨床實踐的發(fā)展,但仍有許多在體實驗無法在真人身上進行,因此動物實驗仍是研究疾病發(fā)病機理、臨床表現(xiàn)等的重要方法,其可以較全面的了解相應(yīng)的生理學和病理學信息,改善疾病尤其是惡性疾病的治療方式,從而為開發(fā)新的診療技術(shù)提供有利保證。如前所述,小動物光學在體分子成像技術(shù)能在較短時間內(nèi)提供生物組織內(nèi)部細胞層面的高分辨率圖像,并能跟蹤病變組織的變化,進而從細胞水平和基因研究的角度獲得疾病發(fā)生發(fā)展等生理學和病理學方面的詳細資料,尤其是對惡性疾病如腫瘤等病變組織的活體成像研究,將大大推動人類對此類疾病的認識,有助于醫(yī)療工作者早日研究出治療此類疾病的有效方法(Baker M. Whole-animal imaging:The whole picture[J]. Nature,2010,463(7283):977-980.)。本論文第一部分借助中國科學院自動化研究所分子影像重點實驗室所擁有的IVIS200分子影像成像系統(tǒng)(Xenogen精諾真公司),在光學分子影像技術(shù)輔助下構(gòu)建了裸鼠肝癌皮下及原位模型,實現(xiàn)了無創(chuàng)、實時、連續(xù)、直觀地觀測裸鼠活體內(nèi)肝癌腫瘤的生物學行為,為后續(xù)研究肝癌的致病機理、藥物療效評估和手術(shù)治療方法等方面搭建了良好的前期動物模型平臺。肝臟腫瘤性疾病常用影像學方法來評價治療效果,如通過觀察一定時間內(nèi)腫瘤體積大小改變來觀察療效,而臨床對疾病的影像學診斷是以人體的病理形態(tài)改變?yōu)榛A(chǔ),其遠遠落后于在分子、細胞水平的病變。光學分子影像技術(shù)可在分子水平層面對病變進行檢測,而不單單是疾病終末期的解剖形態(tài)改變,如化療只需觀察治療藥物的作用靶點變化情況,藥物作用過程中一些關(guān)鍵的分子標記變化情況,即可推斷這種治療方法有無產(chǎn)生效用。所以,光學分子影像技術(shù)可較常規(guī)影像手段更早地發(fā)現(xiàn)病變,并對病變進行定性分析,使得臨床醫(yī)生可以在疾病的發(fā)生、形成階段就對其進行有效的干預(yù),達到早期觀察治療效果的目的(Zhang Q, Du Y, Xue Z, et al. Comprehensive Evaluation of the Anti-Angiogenic and Anti-Neoplastic Effects of Endostar on Liver Cancer through Optical Molecular Imaging. PLoS One,2014,9(1):8555-9.).近年來,芹黃素因其被證明具有抗炎、清除自由基和抗癌的潛力已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤的研究中,它是天然存在的一種黃酮類化合物,具有潛在的抗腫瘤活性。多項研究表明,芹黃素對于結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、子宮肉瘤等均具有明顯的抑制作用(Shukla S, Gupta S. Apigenin:a promising molecule for cancer prevention. Pharm Res,2010, 27(6):962-78.)。本論文第二部分我們利用已成功構(gòu)建的裸鼠肝癌皮下及原位模型結(jié)合光學分子影像技術(shù)探討和驗證了芹黃素對肝癌的抑制作用,為發(fā)現(xiàn)新的肝癌治療藥物提供了有益的參考價值。小動物活體光學分子成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光成像(Bioluminescence imaging, BLI)和熒光成像(Fluorescence imaging, FMI)兩種方法,目前該技術(shù)主要用于觀測藥物代謝及靶向作用；基因的表達反應(yīng)過程；標記示蹤不同種類的干細胞；監(jiān)測了解炎性反應(yīng)過程；器官移植模型的監(jiān)測；腫瘤原發(fā)、轉(zhuǎn)移病灶的發(fā)現(xiàn)；抗腫瘤藥物篩選；細菌病毒的繁殖生長及控制等。具體應(yīng)用原理主要包括：(1)、利用熒光素本身在體內(nèi)的特異性或非特異性分布,達到研究該熒光素在體內(nèi)代謝過程的目的,本論文第三部分正是利用吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)的熒光特性來監(jiān)測其在肝臟代謝的過程；(2)、應(yīng)用標記的熒光報告基團,研究被其標記的靶點在體內(nèi)的分布和動態(tài)變化過程；(3)、使用不同種類的熒光素酶基因標記DNA或細胞,對基因靶點和表達所產(chǎn)生的生物反應(yīng)過程予以監(jiān)測,研究細胞及其以下水平的生物變化過程；(4)、應(yīng)用與相關(guān)藥物標記的熒光報告基團在體內(nèi)的分布代謝情況,了解藥物的療效作用以及病變的轉(zhuǎn)歸等(Weissleder R, Pittet MJ. Imaging in the era of molecular oncology. Nature,2008, 452(7187):580-9.)。本論文第三部分將新型的在體分子熒光成像技術(shù)與經(jīng)典的ICG肝臟功能檢測實驗相結(jié)合,研究了多藥耐藥相關(guān)蛋白2 (multidrug resistance associated protein2, MRP2)對ICG在肝臟代謝的作用,證明了MRP2是ICG在肝臟排泄的通道之一,對于光學分子成像技術(shù)應(yīng)用于肝臟生理和病理機制的研究提供了初步引導(dǎo)作用,相信該技術(shù)在肝臟病理生理學研究中將成為一項新的研究手段。在醫(yī)學臨床實踐中,外科醫(yī)生在手術(shù)過程中通常依據(jù)腫瘤組織的色澤、形態(tài)、質(zhì)地以及術(shù)前影像學資料等進行判斷并切除,所以切除的范圍與外科醫(yī)生的臨床經(jīng)驗密切相關(guān)。如果能有一種方法可以在術(shù)中幫助外科醫(yī)生客觀的判斷出腫瘤的邊界和數(shù)目,那么勢必將大大提高手術(shù)腫瘤切除率、降低腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率、減少再次手術(shù),從而減少醫(yī)療費用、加快病人康復(fù)進程。2013年《自然醫(yī)學》雜志提出,術(shù)中精確獲取腫瘤邊界信息將為臨床手術(shù)提供重要的價值,與術(shù)中憑借醫(yī)生主觀視覺檢查和觸診的方法相比,借助術(shù)中光學分子影像學的方法可以有效客觀的評價腫瘤及其殘存病灶組織,實現(xiàn)精確診療的目的(Nguyen QT, Tsien RY. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation--a new cutting edge. NatRev Cancer,2013,13(9):653-62.)。一般來說,術(shù)中影像學設(shè)備需要滿足無輻射、高信背比的實時成像、操作方便簡單等條件。目前,傳統(tǒng)的臨床診斷方法如CT、MRI、PET等設(shè)備因體積較大、操作復(fù)雜、成像時間長、不易搬動且有一定的輻射損害,均很難在術(shù)中實現(xiàn)有效的應(yīng)用,所以需要進一步探索手術(shù)過程可以實時成像、操作方便、非侵入、無損害的成像設(shè)備。由中國科學院自動化研究所研制的光學分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)(Surgical navigation system,SNS)基本滿足了上述條件,相比目前其他的術(shù)中成像系統(tǒng),SNS不僅具有操作簡便的特性,確保較高信背比實時成像的同時,該系統(tǒng)還可以提供術(shù)中的實時解剖結(jié)構(gòu)圖像,這種高分辨率、高靈敏度和低噪聲的圖像為外科醫(yī)生臨床精確定位操作提供了重要保證。近年來,ICG由于具有產(chǎn)生近紅外熒光的特點被發(fā)掘為乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢的試劑,初步的研究結(jié)果顯示皮內(nèi)注射ICG通過熒光導(dǎo)向可以尋找到前哨淋巴結(jié),與傳統(tǒng)方法相比具有較高的檢出率及較低的假陰性率(Chi C, Ye J, Ding H, et al. Use of Indocyanine Green for Detecting the Sentinel Lymph Node in Breast Cancer Patients:From Preclinical Evaluation to Clinical Validation. PLoS One,2013,8(12):8273-9.)。本論文第四部分也是利用ICG近紅外熒光特性探索了其在SNS引導(dǎo)下應(yīng)用于肝臟腫瘤精準切除的可行性,圍繞肝癌的原位瘤和皮下瘤開展了前期動物實驗和后期初步臨床驗證,實驗結(jié)果證明了SNS能夠快速準確定位肝臟腫瘤位置,給出客觀的腫瘤邊界信息。根據(jù)動物實驗統(tǒng)計結(jié)果,通過光學分子影像手術(shù)導(dǎo)航方法切除腫瘤的裸鼠,生存時間明顯長于常規(guī)肉眼手術(shù)切除方法的裸鼠,這也說明這種精確治療可以有效的提高生存率,改善預(yù)后效果,為以后的臨床廣泛應(yīng)用打下基礎(chǔ),希望在不久的將來,基于光學分子影像的手術(shù)導(dǎo)航方法可以在腫瘤精確定位切除中得到廣泛應(yīng)用。一、光學分子影像技術(shù)輔助下肝癌動物模型的建立目的：1.借助光學分子影像技術(shù)構(gòu)建裸鼠皮下和原位移植性肝癌動物模型。2.為后續(xù)肝癌藥物療效評估和診療搭建前期動物模型平臺。方法：1.HepG2-fLuc和HepG2-GFP標記的肝癌細胞裸鼠皮下肝癌模型的建立取20只4-6周雄性BALB/c裸鼠,分別抽取含1.0×107/mlHepG2-fLuc和HepG2-GFP細胞懸液接種于裸鼠腋部皮下,HepG2-fLuc細胞接種于左腋下,HepG2-GFP細胞接種于右腋下,各10只,建立裸鼠皮下移植性肝癌模型。2.HepG2-fLuc標記的肝癌細胞裸鼠原位肝癌模型的建立無菌條件下麻醉裸鼠,經(jīng)右側(cè)肋緣下1cm斜切口開腹顯露肝臟,沿肝臟被膜下進針,緩慢推入含1.0×107/ml HepG2-fLuc細胞懸液,逐層關(guān)腹,同樣方法建立10只原位模型。3.以上兩種裸鼠肝癌模型在腫瘤細胞接種完成后,借助IVIS 200分子影像系統(tǒng)每日觀察裸鼠的出瘤及遠處轉(zhuǎn)移情況并測量熒光強度、進行三維重建測量腫瘤體積等、繪制體積/熒光/時間增長曲線、統(tǒng)計成瘤率、記錄荷瘤裸鼠生存時間。荷瘤裸鼠死亡后,剝離瘤塊進行病理學檢查。4.統(tǒng)計學處理對于連續(xù)變量采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,對腫瘤體積和熒光強度隨時間增長情況進行一般性統(tǒng)計描述,對于腫瘤體積大小和熒光強度變化雙變量進行Pearson相關(guān)性分析,P0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。采用IBMSPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,Prism5.0軟件繪制圖表。結(jié)果：1.二維定量分析結(jié)果使用工具欄中的感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)定量分析工具條對熒光信號進行圈選定量,定量數(shù)據(jù)出現(xiàn)在ROI上方,信號的強弱以圖中的假色條表示,藍色表示信號弱,紅色表示信號強,假色條上均有數(shù)值標尺,下方顯示定量單位及數(shù)值上下限。2.三維重建結(jié)果三維可視化模型分別從冠狀面、矢狀面和水平面再現(xiàn)了裸鼠各臟器結(jié)構(gòu),且可以任意角度旋轉(zhuǎn)放大透明化,并可以顯示腫瘤位置和定量測量腫瘤體積,便于觀察。3.裸鼠成瘤情況皮下腫瘤模型組,20只裸鼠全部成瘤,成瘤率100%,均沒有發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移病灶；原位腫瘤模型組,在開腹腫瘤細胞種植過程中,3只裸鼠由于麻醉過度死亡(另追加3只裸鼠補齊),其中9只裸鼠全部成瘤,成瘤率90%,3只發(fā)現(xiàn)遠處臟器轉(zhuǎn)移病灶,4只出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移病灶,腫瘤轉(zhuǎn)移率70%,全部裸鼠瘤細胞接種后均未出現(xiàn)感染等并發(fā)癥。4.生物熒光成像(Bioluminescence imaging, BLI)和自發(fā)熒光成像(Fluorescence imaging, FMI)增長情況為了監(jiān)測皮下和原位HepG2-fluc-GFP腫瘤的進展,全部裸鼠在腫瘤細胞接種后12h即開始進行BLI和FMI圖像數(shù)據(jù)采集�？梢钥闯�,無論皮下腫瘤還是原位腫瘤,體積和熒光強度均隨著時間推移不斷增長,一般來說,在接種后的前4天是腫瘤細胞適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境的過程,在10天以后增長明顯加快,定量的生物熒光強度和激發(fā)熒光強度分析結(jié)果也驗證了這一結(jié)論。在腫瘤生長的前3周,荷瘤鼠體重隨之逐漸生長,裸鼠活躍,腫瘤對其影響較小；隨著腫瘤體積的增大,荷瘤鼠體重逐漸減少且活動不便,反映了腫瘤體積增大對裸鼠心、肝、肺等臟器的競爭抑制作用。5.腫瘤體積、生物熒光強度值和激發(fā)熒光強度值相關(guān)性分析(1) HepG2-fluc皮下腫瘤體積和熒光強度Pearson相關(guān)系數(shù)大小為0.998,說明HepG2-fluc皮下腫瘤體積和熒光強度為正相關(guān),即體積越大,熒光強度值越高,對相關(guān)系數(shù)雙側(cè)檢驗的P=0.000,說明該相關(guān)系數(shù)具有統(tǒng)計學意義。(2) HepG2-GFP皮下腫瘤體積和熒光強度Pearson相關(guān)系數(shù)大小為0.998,說明HepG2-GFP皮下腫瘤體積和熒光強度為正相關(guān),即體積越大,熒光強度值越高,對相關(guān)系數(shù)雙側(cè)檢驗的P=0.000,說明該相關(guān)系數(shù)具有統(tǒng)計學意義。(3) HepG2-fluc原位腫瘤體積增長和相應(yīng)生物熒光強度的Pearson相關(guān)系數(shù)大小為0.954,說明HepG2-fluc原位腫瘤體積和熒光強度為正相關(guān),即體積越大,熒光強度值越高,對相關(guān)系數(shù)雙側(cè)檢驗的P=0.000,說明該相關(guān)系數(shù)具有統(tǒng)計學意義。(4)個別腫瘤在生長到一定程度后,由于內(nèi)部血供不足,呈現(xiàn)局部壞死病灶,結(jié)締組織將瘤體分為多個小的腫瘤灶。腫瘤病灶的中央壞死將導(dǎo)致腫瘤體積測量大小跟熒光強度的采集出現(xiàn)不一致的結(jié)果,而腫瘤生物熒光的強度和激發(fā)熒光的強度均反映了腫瘤內(nèi)活細胞的數(shù)量,故兩者也呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,但實驗數(shù)據(jù)采集過程中我們發(fā)現(xiàn),BLI成像的靈敏度明顯高于FMI的成像靈敏度,在腫瘤接種早期,生物熒光相對激發(fā)熒光更能夠精確地反映腫瘤細胞的生長狀態(tài)。結(jié)論：1.裸鼠皮下和原位移植性肝癌模型具有操作簡便、成瘤率高、腫瘤生長周期短、易于控制等優(yōu)點,是研究肝癌生物學行為和篩選抗癌藥物及診療方式的理想模型。2.腫瘤生物熒光強度和激發(fā)熒光強度和腫瘤體積均呈現(xiàn)高度相關(guān)性,可反映腫瘤內(nèi)活細胞數(shù)量。3.光學分子影像技術(shù)可以實現(xiàn)無創(chuàng)、實時、動態(tài)、連續(xù)、直觀地觀測裸鼠活體內(nèi)肝癌腫瘤的生物學行為。二、光學分子影像技術(shù)輔助下芹黃素對肝癌抑制作用的研究目的：1.光學分子影像技術(shù)輔助下研究芹黃素對肝癌的抑制作用,以期為發(fā)現(xiàn)新的肝癌治療藥物提供有益的參考。2.探索驗證光學分子影像技術(shù)在觀察藥物抗肝癌療效中的應(yīng)用價值。方法：1.肝癌皮下腫瘤抑制實驗將20只Balb/c裸鼠隨機分為2組：對照組(生理鹽水組)和實驗組(芹黃素組),每組各10只,按照本論文第一部分介紹方法分別用HepG2-fLuc和HepG2-GFP標記的肝癌細胞懸液接種到裸鼠上肢左腋窩和右腋窩處建立肝癌皮下腫瘤模型。2.肝癌原位腫瘤抑制實驗將20只Balb/c裸鼠隨機分為2組：對照組(生理鹽水組)和實驗組(芹黃素組),每組各10只,按照本論文第一部分介紹方法分別用HepG2-fLuc標記的肝癌細胞懸液接種到肝臟包膜下建立肝癌原位腫瘤模型。3.給藥方法待皮下和原位肝癌移植模型成功建立后開始根據(jù)各實驗分組情況給予相應(yīng)的不同藥物處理：(1)對照組：每3天腹腔注射等容量的無菌生理鹽水,共7次；(2)實驗組：芹黃素50mg/kg,腹腔注射,每3天注射1次,共7次。4.各組比較和檢測指標每天觀察裸鼠的體重、精神狀態(tài)、飲食情況、活動規(guī)律及排便等一般情況觀察。IVIS 200分子影像系統(tǒng)測量腫瘤熒光強度變化,三維重建測量腫瘤體積變化,并繪制比較各組肝癌移植瘤體積和熒光強度增長曲線。5.動物處置與標本獲取待全荷瘤鼠死亡后,剝離瘤體,觀察大體形態(tài)并稱取瘤重,將各個瘤組織分成兩部分,一部分固定包埋后做病理檢查,余下的瘤組織放一80℃凍存。6.統(tǒng)計學處理：連續(xù)變量采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組間整體比較采用重復(fù)測量資料的方差分析,單獨時間點比較采用獨立樣本t檢驗。用Kaplan-Meier法繪制荷瘤裸鼠生存時間并用log rank檢驗比較。數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS 19.0軟件分析,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,Prism5.0軟件繪制圖表。結(jié)果：1.裸鼠一般情況20只皮下腫瘤裸鼠接種肝癌細胞10天左右,出現(xiàn)粟粒大小的類圓形結(jié)節(jié),高出皮膚表面,質(zhì)韌,可活動,以后結(jié)節(jié)逐漸增大,移植成功率為100%。20只原位腫瘤裸鼠接種腫瘤細胞時術(shù)中死亡4只,由相應(yīng)數(shù)量裸鼠補齊。皮下和原位腫瘤在接種后20天內(nèi),腫瘤增長速度較緩慢,裸鼠精神良好,反應(yīng)敏捷,飲食、大小便及活動正常,皮膚顏色如常,移植瘤組織未見破潰：在接種之后的第21到30天期間,腫瘤增長速度開始加快,裸鼠的精神狀態(tài)較之前開始變得萎靡不振、活動減少、反應(yīng)遲鈍、消瘦等；從第30天以后,腫瘤增長的速度更加迅速,以對照組腫瘤增長速度最快,裸鼠變得愈加萎靡不振,基本上不活動,飲食和飲水量急劇減少,身體變得愈加消瘦。2.芹黃素抗肝癌腫瘤作用(1)裸鼠肝癌皮下腫瘤實驗待肝癌移植模型成功建立后按分組情況開始給藥,治療開始后每天測量移植瘤體積及相應(yīng)熒光強度值,并繪制移植瘤體積和熒光強度增長曲線。繪制荷瘤裸鼠成瘤20天后實驗組和對照組兩組腫瘤(包括HepG2=fLuc和HepG2-GFP兩種細胞標記的皮下腫瘤模型)各時間點腫瘤體積和熒光強度增長曲線可以得出,BLI和FMI信號強度值在各時間點實驗組顯著低于對照組,并且始終保持這種抑制狀態(tài)。在腫瘤接種后第45天抑制作用最為顯著,芹黃素在瘤重、腫瘤體積及熒光強度方面均表現(xiàn)出對裸鼠皮下腫瘤的抑制作用。裸鼠死亡后,剝離瘤體,觀察其大體形態(tài)可見：腫瘤呈結(jié)節(jié)狀,包膜完整,血供豐富,切面呈灰白色和少量出血壞死灶,無周圍組織浸潤。①.組間整體比較：A.在BLI皮下腫瘤體積方面,可以看出實驗組分別在第20d、25d、30d、35d、40d、45d 6個時間點均低于對照組,對兩組各時間點熒光值進行重復(fù)測量資料的方差分析,組間因素的比較,即實驗組與對照組相比,F=579.544,P=0.000,兩組差異有統(tǒng)計學意義。B.在BLI皮下腫瘤熒光強度方面,可以看出實驗組分別在第20d、25d、30d、35d、40d、45d6個時間點均低于對照組,對兩組各時間點熒光值進行重復(fù)測量資料的方差分析,組間因素的比較,即實驗組與對照組相比,F=293.045,P=0.000,兩組差異有統(tǒng)計學意義。C.在FMI皮下腫瘤體積方面,可以看出實驗組分別在第20d.25d.30d.35d.40d、45d 6個時間點均低于對照組,對兩組各時間點熒光值進行重復(fù)測量資料的方差分析,組間因素的比較,即實驗組與對照組相比,F=109.346,P=0.000,兩組差異有統(tǒng)計學意義。D.在FMI皮下腫瘤熒光強度方面,可以看出實驗組分別在第20d、25d、30d、35d、40d、45d 6個時間點均低于對照組,對兩組各時間點熒光值進行重復(fù)測量資料的方差分析,組間因素的比較,即實驗組與對照組相比,F=422.243,P=0.000,兩組差異有統(tǒng)計學意義。②.單獨時間點比較：A.在HepG2一fLuc標記的皮下腫瘤模型中,實驗組和對照組在腫瘤細胞接種后第45天時腫瘤瘤重、腫瘤體積和BLI熒光強度比較,實驗組在腫瘤瘤重(0.519±0.076g vs 0.859±0.114g,t=7.862,P=0.000).腫瘤體積(400.80±37.154mm3vs 624.30±39.797mm3,t=12.981,P=0.000)和BLI熒光強度(4543000.00±401221.745 photons/cm2 vs 6994000.00±395592.383 photons/cm2,,f=13.756,P=0.000)方面均顯著低于對照組,兩組差異均有統(tǒng)計學意義。B.在HepG2-GFP標記的皮下腫瘤模型中,實驗組和對照組在腫瘤細胞接種后第45天時腫瘤瘤重、腫瘤體積和FMI熒光強度比較,實驗組在腫瘤瘤重(0.447±0.939g vs 0.756±0.117g,t=7.779,P=0.000)、腫瘤體積(373.50±31.160mm3 vs 564.20±42.512mm3,t=11.441,p=0.000)和FMI熒光強度(3.51×109±2.456×108 photons/cm2 vs 4.47×109±1.677×108 photons/cm2,t=10.206,P=0.000)方面均顯著低于對照組,兩組差異均有統(tǒng)計學意義。C.而在體重方面實驗組和對照組兩組差異無統(tǒng)計學意義(19.700±2.540g vs19.830±2.239g,t=0.121,P=0.905)。(2)裸鼠肝癌原位腫瘤實驗：①.組間整體比較：腫瘤成瘤5天后各時間點實驗組和對照組兩組原位腫瘤體積和BLI熒光強度增長曲線A.在原位腫瘤體積方面,可以看出實驗組在各時間點均低于對照組,對兩組各時間點熒光值進行重復(fù)測量資料的方差分析,組間因素的比較,即實驗組與對照組相比,F=293.045,P=0.000,兩組差異有統(tǒng)計學意義。B.在BLI熒光強度方面,可以看出實驗組在各時間點均低于對照組,對兩組各時間點熒光值進行重復(fù)測量資料的方差分析,組間因素的比較,即實驗組與對照組相比,F=1342.145,P=0.000,兩組差異有統(tǒng)計學意義。以上均說明芹黃素對肝癌具有明顯的抑制作用。②.單獨時間點比較：A.實驗組和對照組在腫瘤細胞接種后第5天時腫瘤體積、熒光強度比較,實驗組在腫瘤體積(29.10±5.405 mm3 vs 30.20±6.663mm3,,t=0.405,P=0.690)和熒光強度(349500.00±10394.977 photons/cm2 vs 349700.00±16193.620 photonS/cm2,t=0.033,p=0.974)方面兩組差異無統(tǒng)計學意義。B.實驗組和對照組在腫瘤細胞接種后第35天時腫瘤體積、熒光強度及裸鼠體重變化比較,實驗組在腫瘤體積(161.80±16.212 mm3 vs 328.90± 9.949mm3.t=27.779,P=0.000)和熒光強度(865600.00±21613.782 photons/cm2 vs 1249000.00±5384l.331 photons/cm2,t=20.897,P=0.000)方面均顯著低于對照組,而在體重方面(22.800±2.732g vs 18.740±1.585g,t=-4.065,P=0.001)實驗組高于對照組,兩組差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：1.芹黃素對肝癌具有明顯的抑制作用,為肝癌的綜合治療提供了新方案。2.光學分子影像技術(shù)能直接快速的測量肝癌腫瘤模型中腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及對藥物的反應(yīng),在對藥物的篩選和評價中具有重要應(yīng)用價值。三、光學分子影像技術(shù)輔助下MRP2在ICG肝臟代謝中的作用研究目的：1.借助光學分子影像技術(shù)明確MRP2在ICG肝臟代謝中的作用。2.探索驗證光學分子影像技術(shù)在肝臟病理生理學機制研究中的應(yīng)用價值。方法：1.主要實驗試劑注射用吲哚菁綠(ICG)和MRP2抑制劑MK-571。2.主要實驗儀器IVIS 200非侵入式定量分子影像系統(tǒng)3.實驗對象和分組取20只4-8周健康BALB/c小白鼠隨機分為2組：對照組A組：ICG+生理鹽水；實驗組B組：ICG+MK-571,每組10只。4.動物活體成像記錄方法小白鼠麻醉后,俯臥平放于IVIS分子影像系統(tǒng)的記錄暗箱中。首先掃描并拍攝藥物注射前動物活體成像圖1張,實驗組實驗前1h行MK-571腹腔注射(注射劑量4mg/kg),然后進行ICG (0.5mg/kg)尾靜脈注射,對照組注射等量的生理鹽水和ICG,此后每10min進行一次小鼠熒光成像掃描并記錄一張動物體內(nèi)ICG熒光圖像,分析ICG在肝臟的分布、代謝過程,連續(xù)觀察90min并繪制代謝曲線圖,分析動物體內(nèi)熒光分布的改變和MRP2對ICG代謝的影響,并與對照組比較。為了研究ICG在小白鼠體內(nèi)實驗最佳注射劑量,預(yù)實驗我們另用15只健康BALB/c小白鼠隨機分為3組,每組5只,分別用三種不同ICG注射劑量(0.1mg/kg, 0.5mg/kg, 1.0mg/kg),在注射后第5min、10in、20min、40min、 60min、80min6個時間點分別測量ICG熒光強度值變化并繪制代謝曲線圖,結(jié)果證實0.5 mg/kg為小白鼠體內(nèi)實驗最佳注射劑量。5.ICG肝臟內(nèi)熒光發(fā)光強度的定量化分析采用Living Image(?) Software 4.0 for IVIS(?) Spectrum軟件對各組各時間點的ICG肝臟熒光分布進行量化分析,了解各組各時間點肝臟ICG熒光分布的部位、范圍和強度；用圖像分析中的圓形區(qū)域即工具欄中的感興趣區(qū)域(region of interest, ROI)選擇程序提取各組肝臟區(qū)域熒光均值。分別計算各組各時間點肝臟熒光強度均值。6.統(tǒng)計學處理用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對兩組各時間點熒光值進行重復(fù)測量資料的方差分析,結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,Prism5.0軟件繪制圖表。結(jié)果：1.肝臟活體熒光成像圖顯示ICG注射即刻小鼠肝臟就有團狀聚集的熒光顯示,10min后達到最高值,注射后20-30min時,熒光強度一直保持在較高水平,到80min時,熒光已減至較弱的水平。整個觀察過程與已知的ICG在肝臟代謝活動基本同步,說明應(yīng)用在體熒光成像技術(shù)研究MRP2在ICG肝臟代謝中的作用是可行和可靠的方法。2.MRP2對ICG在肝臟代謝的影響在10min時,ICG熒光實驗組即顯示出比對照組增強的趨勢,此趨勢一直延續(xù)到觀察結(jié)束。對兩組各時間點熒光強度值進行重復(fù)測量資料的方差分析,組間因素的比較,即實驗組與對照組相比,F=129.051,P=0.000,兩組差異有統(tǒng)計學意義,結(jié)果說明,MRP2抑制劑MK-571顯著延緩了ICG在肝臟的代謝時間,使熒光發(fā)光在肝臟持續(xù)時間延長。結(jié)論：1.MRP2抑制劑MK-571延緩了ICG在肝臟的代謝時間,說明MRP2是ICG在肝臟代謝的通道之一。2.小動物在體分子成像技術(shù)可以連續(xù)、實時、無損傷的對ICG在肝內(nèi)代謝過程進行顯示。四、光學分子影像技術(shù)在確定肝臟腫瘤位置及邊界中的應(yīng)用研究目的：借助光學分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)進行前期動物實驗及初步臨床驗證,以期利用該方法達到在術(shù)中快速、準確、客觀的定位肝臟腫瘤及轉(zhuǎn)移病灶組織的邊界及判斷腫瘤切除后斷面有無殘留病灶,達到精準、完整切除腫瘤的目的。(一)前期動物實驗方法：1.主要實驗試劑注射用吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)。2.主要實驗儀器IVIS 200非侵入式定量分子影像系統(tǒng)光學分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)(Surgical navigation system, SNS)3.實驗對象和分組將30只Balb/c裸鼠分別用HepG2-fLuc標記的細胞接種到上肢左腋窩后隨機分為2組：對照組(常規(guī)手術(shù)組)和實驗組(SNS引導(dǎo)手術(shù)組),每組各15只。4.實驗方法手術(shù)導(dǎo)航方法與常規(guī)方法對比切除裸鼠皮下腫瘤待腫瘤細胞接種裸鼠成瘤第45天后,將SNS擺設(shè)于裸鼠手術(shù)臺前,固定好后設(shè)置固定參數(shù),將近紅外激發(fā)光源固定于離裸鼠手術(shù)臺面約10cm距離,荷瘤裸鼠麻醉后,仰臥位固定,調(diào)整SNS系統(tǒng),確保裸腫瘤區(qū)域在成像系統(tǒng)可拍攝的范圍內(nèi),消毒,鋪巾,用1ml注射器接頭皮針(以確保容易控制ICG的注射劑量)抽取ICG0.2ml尾靜脈注射,實時采集熒光及可見光圖像,可以在顯示器上觀察到腫瘤顯像,醫(yī)生在圖像的引導(dǎo)下,精確定位腫瘤位置及邊界,顯示為高熒光強度結(jié)節(jié)影判定為腫瘤,常規(guī)切開皮膚、皮下組織,切取高熒光強度結(jié)節(jié)(即腫瘤),術(shù)后縫合皮膚及皮下組織。整個手術(shù)過程中手動采集圖像(術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后),術(shù)后用Living Image(?) Software 4.0 for IVIS(?) Spectrum軟件分析及處理實驗圖片。在常規(guī)手術(shù)組中,由同一位醫(yī)生憑借經(jīng)驗切除裸鼠的皮下腫瘤,在腫瘤切除以后,通過腹腔注射熒光底物,觀察是否有腫瘤殘余。統(tǒng)計兩組裸鼠術(shù)后腫瘤殘余率和生存時間。5.組織病理驗證將切下的腫瘤組織利用冰凍切片包埋劑(optimum cutting temperature OCT)進行包埋和連續(xù)切片,然后將組織切片用蘇木精和伊紅(HE)染色法進行染色固定。6.統(tǒng)計學分析連續(xù)變量采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,對于計數(shù)資料,組間比較采用x2檢驗或Fisher's精確檢驗統(tǒng)計分析。用Kaplan-Meier法繪制荷瘤鼠術(shù)后生存曲線并用log rank檢驗比較兩組生存時間。數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS 19.0軟件分析,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,Prism5.0軟件繪制圖表。結(jié)果：SNS手術(shù)導(dǎo)航組在腫瘤殘余率(6.7% vs.46.7%,p=0.035)方面顯著少于常規(guī)手術(shù)組,常規(guī)手術(shù)組裸鼠的生存天數(shù)最小值為19天,最大值為48天,生存均值為36天,生存中位數(shù)為38天,手術(shù)導(dǎo)航組裸鼠的生存天數(shù)最小值為43天,最大值為68天,生存均值為54天,生存中位數(shù)為54天,生存時間明顯長于常規(guī)肉眼手術(shù)切除方法的裸鼠,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(p=0.000),這也說明這種精確治療可以有效的提高生存率,改善預(yù)后效果。(二)初步臨床驗證方法：1.研究對象選擇對象為在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院肝膽一科住院待手術(shù)病人。(1)入選標準：①術(shù)前影像學檢查結(jié)合腫瘤指標診斷為肝臟腫瘤占位性疾病,具有明確的手術(shù)切除指征或手術(shù)探查指征。②綜合評估后可耐受手術(shù)者；③簽署知情同意書。(2)排除標準：①試刑“吲哚菁綠”皮試陽性。②有明確的手術(shù)、麻醉禁忌。③無人身自由及獨立民事行為能力者。(3)剔除標準：①出現(xiàn)嚴重過敏反應(yīng)者。②出現(xiàn)持續(xù)性過敏反應(yīng)者。③受試者要求退出臨床試驗者。④研究者認為不宜繼續(xù)參加本臨床試驗者。2、倫理學要求遵循赫爾辛基宣言和中國有關(guān)臨床試驗研究規(guī)范、法規(guī)進行。在試驗開始之前,已通過本實驗研究單位南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院倫理委員會批準認定。3.實驗方法本研究采光學分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)引導(dǎo)下的ICG對肝臟腫瘤患者進行腫瘤切除手術(shù),將切除的病灶行病理檢查,探討其在肝臟腫瘤邊界界定及發(fā)現(xiàn)殘余病灶中的臨床應(yīng)用價值。4.實驗流程①ICG的靜脈注射劑量為0.5mg/kg。②ICG靜脈注射的時間平均為手術(shù)前1天。③ICG注射到術(shù)中開始檢測熒光間的時間窗口對無明確肝硬化表現(xiàn)患者為24小時；對于可能存在肝硬化的患者為24-48小時。原因是肝功能不良時,肝臟組織對ICG的排泄也會減慢,這就需要相應(yīng)的延長窗口期。④術(shù)中偵測：檢測設(shè)備在距離手術(shù)野60cm處進行偵測,不會污染手術(shù)野。5.安全性評價試驗中密切觀察不良事件觀察并評價,對臨床出現(xiàn)的不良反應(yīng),需隨訪至癥狀消失。結(jié)果：自2014年12月到2015年3月,共5例病人在我院實施了在光學分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)引導(dǎo)下的肝臟腫瘤切除術(shù),其中3例為肝細胞癌,1例為轉(zhuǎn)移性肝癌,1例為局灶增生性結(jié)節(jié)。所有受試者在提供書面知情同意后,醫(yī)生對實驗流程進行充分解釋。所有患者術(shù)前均行腹部超聲和增強CT檢查及皮下ICG過敏測試。5例患者原發(fā)腫瘤病灶在光學分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)下均顯示明亮的熒光信號,從而可快速、準確定位腫瘤位置,引導(dǎo)醫(yī)生進行準確切除,所有注射ICG的患者均未出現(xiàn)副作用。結(jié)論：利用光學分子影像手術(shù)導(dǎo)航的方法可以對肝臟腫瘤進行術(shù)中精確定位,明確的顯示出腫瘤的邊界,同時可以在術(shù)中幫助醫(yī)生判斷腫瘤切除后斷面有無殘留病灶,以及判斷是否有轉(zhuǎn)移。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7;R-332
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本文編號：1167697