發(fā)布時間：2017-11-10 00:17

  本文關鍵詞：吡非尼酮抑制眼眶成纖維細胞應力纖維及粘著斑重構作用和細胞功能的實驗研究

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【摘要】：第一部分眼外肌來源成纖維細胞的原代培養(yǎng)、鑒定及誘導分化目的:研究TAO眼外肌來源的成纖維細胞,在TGF-β1作用下的細胞生長分化狀態(tài)。方法:通過組織塊培養(yǎng)法收集TAO眼外肌來源的成纖維細胞,進行細胞形態(tài)及免疫標記物鑒定為成纖維細胞;通過MTT法觀察成纖維細胞在不同濃度TGF-β1(1μg/L、5μg/L、10μg/L)誘導后的增殖效應;通過免疫細胞化學法檢測成纖維細胞表達α-SMA;通過Western檢測不同濃度(1μg/L、5μg/L、10μg/L)和時間(24h、48h、72h)效應下,TGF-β1誘導成纖維細胞表達α-SMA水平。結果:⑴原代和傳代培養(yǎng)的細胞呈長梭形,胞漿豐滿,核呈圓形或橢圓形,核仁清晰,細胞融合后呈放射狀、漩渦狀排列緊密;免疫細胞化學染色顯示:vimentin陽性表達,Desmin、Kerati、S-100、第Ⅷ因子呈陰性反應,可以鑒定TAO組和正常對照組眼外肌標本培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。⑵MTT法檢測TGF-β1誘導72h后的成纖維細胞增殖率具有劑量效應,10μg/L TGF-β1組細胞增殖率最高,為107.35%(P㩳0.05);TAO組和正常對照組的成纖維細胞MTT光密度值比較,差別不具有統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。⑶10μg/L TGF-β1處理24h,成纖維細胞胞漿豐滿,體型增大,細胞足突增多;免疫細胞化學染色顯示胞漿內(nèi)大量α-SMA表達,強陽性染色;陰性處理組細胞內(nèi)表達α-SMA量少。⑷Western-blot檢測TGF-β1誘導成纖維細胞表達α-SMA蛋白具有劑量和時間效應,10μg/L TGF-β1處理48h具有最大表達量(P㩳0.05);TAO組和正常對照組的成纖維細胞α-SMA蛋白表達量相互比較,差別不具有統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。結論:利用組織塊貼壁法培養(yǎng)的成纖維細胞的形態(tài)學和免疫學特征明顯,可用于甲狀腺相關眼病的體外研究對象。TGF-β1具有促進成纖維細胞增殖和向肌纖維母細胞分化作用,其誘導的α-SMA表達水平增高在一定范圍內(nèi)具有濃度和時間依賴性。第二部分吡非尼酮抑制成纖維細胞增殖、分化、遷移及收縮功能的實驗研究目的:研究吡非尼酮對TAO眼外肌成纖維細胞的增殖、分化、遷移和收縮膠原作用的影響。方法:在不同濃度TGF-β1、吡非尼酮、地塞米松作用下,通過MTT法檢測成纖維細胞增殖作用,臺盼藍染色法檢測細胞存活狀態(tài)。在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮、1000n M地塞米松作用下,利用劃痕實驗檢測細胞遷移作用,免疫細胞化學法檢測細胞表達α-SMA、fibronectin的作用,以及凝膠收縮實驗檢測細胞收縮膠原的作用。結果:⑴MTT法檢測吡非尼酮抑制成纖維細胞增殖率具有劑量效應,0.5mg/ml、1.0mg/ml吡非尼酮的72h細胞增殖率,分別為-24.82%、-41.84%,二者MTT值與空白對照組比較,P㩳0.05;吡非尼酮較地塞米松具有更強的抑制TGF-β1誘導的細胞增殖作用(P㩳0.05)。⑵臺盼藍染色法觀察不同濃度吡非尼酮作用72h后,成纖維細胞活性良好,未見明顯細胞毒性作用。⑶細胞劃痕實驗顯示,TGF-β1具有促進細胞遷移和融合效應;吡非尼酮抑制細胞遷移作用明顯(P㩳0.05)。⑷免疫細胞化學染色顯示,吡非尼酮作用72h后成纖維細胞內(nèi)無明顯α-SMA表達;地塞米松組成纖維細胞內(nèi)正常表達α-SMA�？瞻讓φ战M、TGF-β1組、地塞米松組72h后均可見fibronectin在成纖維細胞內(nèi)外高表達,并聚合成互相連接的纖維網(wǎng)狀結構;吡非尼酮組、吡非尼酮聯(lián)合TGF-β1組72h后fibronectin表達被抑制。⑸凝膠收縮實驗顯示,連續(xù)觀察6天后,TGF-β1組的收縮指數(shù)為59.38%,與空白對照組比較,顯示強大的促進成纖維細胞介導的膠原收縮作用(P㩳0.05);吡非尼酮組、吡非尼酮聯(lián)合TGF-β1組的收縮指數(shù)分別為6.70%和8.02%,具有明顯抑制成纖維細胞介導的膠原收縮作用(P㩳0.05);地塞米松組收縮指數(shù)25.48%,與空白對照組比較無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。結論:吡非尼酮可抑制體外培養(yǎng)眼眶成纖維細胞的增殖和向肌纖維母細胞表型分化;抑制成纖維細胞/肌纖維母細胞的遷移和膠原收縮作用;并且對fibronectin的表達也有明顯的下調(diào)作用。吡非尼酮較地塞米松具有更強的抑制TGF-β1介導的成纖維細胞增殖、分化、遷移和膠原收縮作用。第三部分吡非尼酮抑制眼眶成纖維細胞應力纖維重構及粘著斑成熟作用的實驗研究目的:研究吡非尼酮對TGF-β1誘導下的TAO眼外肌成纖維細胞的肌動蛋白應力纖維構建和粘著斑成熟分化的作用,以及相關信號通路的影響。方法:在10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml吡非尼酮作用下,利用免疫熒光技術和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察肌動蛋白應力纖維、粘著斑蛋白和Ⅰ型膠原形態(tài)及細胞定位,Western-blot檢測Akt、Phospho-Akt、FAK、Phospho-FAK蛋白的表達,以及通過Max GelTM檢測成纖維細胞在細胞外基質中的粘附作用。結果:⑴共聚焦顯微鏡下觀察,吡非尼酮抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞向肌纖維母細胞分化,降低α-SMA陽性應力纖維構建;抑制paxillin、tensin蛋白表達,抑制粘著斑分化成熟,相應粘著斑面積和數(shù)量較空白對照組減小(P㩳0.05)。⑵Western Blot結果顯示,吡非尼酮單獨作用或聯(lián)合TGF-β1均可抑制Akt與磷酸化Akt,FAK與磷酸化FAK表達(P㩳0.05);吡非尼酮對Akt磷酸化抑制作用更明顯(P㩳0.05)。⑶細胞粘附實驗表明,吡非尼酮作用24h后極少細胞粘附生長,明顯抑制成纖維細胞對細胞外基質的粘附作用(P㩳0.05)。結論:通過下調(diào)TGF-β1介導的Akt/FAK信號通路活化,吡非尼酮明顯抑制α-SMA應力纖維構建和粘著斑分化成熟,降低細胞與細胞外基質粘附,阻礙成纖維細胞發(fā)揮促纖維化作用,因此可用于對抗甲狀腺相關眼病纖維化發(fā)展和改善臨床癥狀。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R581;R771.3

【共引文獻】

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本文編號：1164218