本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子KLF9在卵巢癌中的生物學(xué)功能和機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的腫瘤,也是女性腫瘤疾病中最常見的一種,綜合發(fā)病率位列眾多女性易患癌癥第三位,僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌。90%-95%的卵巢癌都為卵巢原發(fā)性癌,其余則往往是由其他部位癌癥轉(zhuǎn)移引起的惡性腫瘤。卵巢癌患者的五年存活率僅有25%-30%。因此,卵巢癌相較宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率更低,但死亡率卻更高,其死亡率甚至超過了宮頸癌與子宮內(nèi)膜癌之和,是威脅女性健康的最大殺手。轉(zhuǎn)錄因子是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一種具有序列特異性DNA結(jié)合能力的蛋白,可以通過激活或者抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控下游基因在細(xì)胞和組織中的時空特異性表達(dá)。在個體細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡及胚胎發(fā)育等各種生理生化過程中發(fā)揮著十分重要的角色。轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤中通常呈現(xiàn)出不同于正常細(xì)胞的表達(dá)方式,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Kruppel-like transcription factors, KLFs)是真核細(xì)胞中廣泛存在一類鋅指DNA結(jié)合蛋白。根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)的特征,又可以細(xì)分為C2H2(two cysteine and two histidine amino acid residues, Cys2/His2)型、C3H4型和C4H4型等。人類基因組中存在700多個含有Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,KLFs就屬于這類轉(zhuǎn)錄因子。目前已發(fā)現(xiàn)至少20種KLFs,他們可以結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)的GC/CACC box和GT/CACC box調(diào)控靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明,KLF家族轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤中發(fā)揮著重要的作用,并且不同的KLF在不同類型的腫瘤中發(fā)揮作用。例如,KLF5在結(jié)腸癌、肺癌中的表達(dá)顯著升高,并具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用,而KLF4在胃癌、肝癌中的表達(dá)顯著降低,提示其可能在這兩種腫瘤中作為一種抑癌基因發(fā)揮功能。KLF9為KLF家族中的重要成員之一,其作用機(jī)制主要通過激活或抑制富含GC box的啟動子來調(diào)控基因的表達(dá)。人KLF9基因位于染色體9q13,基因結(jié)構(gòu)包含2個外顯子,其CDS編碼區(qū)長達(dá)735 bp,編碼144個氨基酸殘基組成的多肽鏈。KLF基因結(jié)構(gòu),羧基末端含3個經(jīng)典且高度保守的Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu),氨基酸位置為143-167,173-197,203-225位,氨基末端富含有天冬氨酸/谷氨酸(Asp/Glu),即酸性氨基酸。結(jié)合DNA依靠位于羧基末端的3個保守的鋅指結(jié)構(gòu),可以結(jié)合到核酸的大溝,從殘基而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。人的KLF9和大鼠KLF9的氨基酸序列相似度高達(dá)98%,說明該蛋白在哺乳動物中具有較高的序列保守性。同KLF家族內(nèi)部的其他眾多成員相比,KLF9具有家族保守的羧基末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,而氨基末端結(jié)構(gòu)則呈現(xiàn)出較大的差異,這種差異可能導(dǎo)致了KLF家族成員轉(zhuǎn)錄活性的差異。KLF9肽鏈羧基末端含有3個串聯(lián)/相鄰的Cys2/His2鋅指的保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,這3個串連的鋅指結(jié)構(gòu)也決定了KLF9的DNA結(jié)合能力,它們通過結(jié)合到DNA的大溝部位來調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,其氨基端富含Asp/Glu等酸性氨基酸殘基,這一結(jié)構(gòu)的存在可能與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用相關(guān)。KLF9可激活含有多個GC box基因的啟動子,但對含有一個GC box基因的啟動子卻有抑制作用。對絕大多數(shù)靶基因而言,KLF9能激活靶基因的表達(dá),但是對個別基因卻起著抑制其表達(dá)的作用。KLF9具有保守的羧基末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,這一點(diǎn)與其他KLF家族成員相似,然而氨基末端結(jié)構(gòu)在各成員之間則變化較大,這可能決定了KLF家族成員轉(zhuǎn)錄活性的差異。研究發(fā)現(xiàn),KLF9基因敲除小鼠能夠在飼養(yǎng)環(huán)境下正常生長,且外部表型與野生型小鼠無異。但雌性KLF9-/-小鼠與野生型相比,其生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能明顯受影響,表現(xiàn)為子宮發(fā)育不良和生殖能力低下,比如胚胎植入數(shù)目和產(chǎn)仔數(shù)下降以及新生仔鼠死亡率增加等。這些現(xiàn)象的出現(xiàn)主要是Ax1、Cyclin D1、LPI、Hoxa10、PR等KLF9的下游基因異常表達(dá)有關(guān)。鑒于KLF9在細(xì)胞生長、增殖、細(xì)胞周期等核心生物學(xué)過程中具有重要作用,而這些這些生命活動的異常與腫瘤有緊密聯(lián)系,據(jù)此我們推測KLF9可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。第一部分KLF9在卵巢癌中的表達(dá)及相關(guān)檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^檢測KLF9在卵巢癌組織和癌旁正常組織中的mRNA的水平和蛋白表達(dá)情況,探索卵巢癌發(fā)病與KLF9表達(dá)的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)方法：隨機(jī)收集20對手術(shù)切除的卵巢癌組織以及癌旁正常組織。首先我們提取了這些組織的mRNA,利用KLF9特異性引物,進(jìn)行了熒光實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn),分析卵巢癌組織以及癌旁正常組織的]mRNA的表達(dá)含量差異。我們隨機(jī)選取了3例卵巢癌組織及其癌旁組織,利用KLF9特異性抗體,采用免疫印跡法,檢測卵巢癌組織以及癌旁正常組織的KLF9蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.我們發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比,KLF9的mRNA水平在卵巢癌組織中顯著升高。2.在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織的KLF9的蛋白水平顯著高于癌旁正常組織,這一結(jié)果與KLF9在卵巢癌組織中的mRNA高表達(dá)一致。因此,以上結(jié)果表明,KLF9在卵巢癌組織中高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：1.與癌旁組織比較,卵巢癌組織中KLF9的mRNA水平顯著升高。2.卵巢癌組織中的KLF9的蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織。3.這一結(jié)果提示我們KLF9在卵巢癌中發(fā)生發(fā)展中起到了一定的作用。我們推測KLF9參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。第二部分KLF9在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^在卵巢癌細(xì)胞株中分別過表達(dá)和干擾表達(dá)KLF9基因,檢測細(xì)胞的活力、增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程等,進(jìn)而通過檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá),以探討KLF9在在卵巢癌病理生理過程中的作用及分子機(jī)制。最后結(jié)合裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn),將卵巢癌細(xì)胞中KLF9干擾表達(dá)后,檢測小鼠腫瘤的形成和生長,以判斷KLF9是否可以作為卵巢癌干預(yù)和治療的有效靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法：1.構(gòu)建了KLF9的過表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株SKOV3。KLF9過表達(dá)后,通過MTT和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測,SKOV3細(xì)胞活力及增殖能力。同時選取另一種卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3細(xì)胞。2.給予卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染KLF9的慢病毒,用于干擾SKOV3細(xì)胞內(nèi)源性KLF9的表達(dá)。檢測細(xì)胞活力及其增殖能力。進(jìn)而,流式細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)測細(xì)胞周期。同時取卵巢癌OVCAR3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.通過實(shí)時定量PCR(Real-time PCR),檢測與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的基因。在KLF9過表達(dá)的SKOV3細(xì)胞中,檢測mRNA在Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1、 Cyclin E、P21、P27等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的值變化。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測KLF9對Cyclin D1的調(diào)控作用。過表達(dá)的OVCAR3細(xì)胞,也檢測其Cyclin D1的表達(dá)。再測KLF9干擾表達(dá)的兩種卵巢癌細(xì)胞中,Cyclin D1的mRNA和蛋白水平。檢測Cyclin D1干擾表達(dá)后,卵巢癌細(xì)胞活力和增殖。4.構(gòu)建了-2000bp至+10bp的Cyclin D1啟動子報(bào)告基因質(zhì)粒,采用熒光素酶雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),檢測該啟動子其活性。構(gòu)建截?cái)噘|(zhì)粒(Truncation),檢測-5000bp至-200bp的Cyclin D1啟動子。運(yùn)用生物信息學(xué)方法,在TESS網(wǎng)站上,檢測該段啟動子300個堿基。采用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測KLF9與該段啟動子結(jié)合后Cyclin D1 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。5.構(gòu)建KLF9干擾表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,并注射裸鼠皮下,觀察小鼠成瘤情況。5周后,殺死小鼠,測腫瘤直徑、容積和重量對,對照組同測。同時檢測KLF9干擾表達(dá)組及對照組的腫瘤細(xì)胞Cyclin D1的mRNA和蛋白水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.KLF9的過表達(dá)具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞活力和增殖的作用。KLF9過表達(dá)后,通過MTT和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測,SKOV3細(xì)胞活力和增殖能力顯著增加。流式細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)表明,細(xì)胞周期加快,表現(xiàn)在G0-G1期細(xì)胞減少,S期細(xì)胞增加。另一種卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3細(xì)胞得到了相同的結(jié)果。2.下調(diào)KLF9的表達(dá)將抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)染KLF9的慢病毒卵巢癌細(xì)胞,其細(xì)胞活力和增殖能力顯著降低。流式細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)表明其細(xì)胞周期減慢,表現(xiàn)在G0-G1期細(xì)胞增加,S期細(xì)胞減少。在OVCAR3細(xì)胞也得到相同結(jié)果。3.KLF9可能通過上調(diào)Cyclin D1的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的增殖。通過實(shí)時定量PCR發(fā)現(xiàn)在KLF9過表達(dá)的SKOV3細(xì)胞中,Cyclin D1的mRNA表達(dá)顯著增加,而Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin E、P21、P27等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白則無顯著變化。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了KLF9對Cyclin D1的調(diào)控作用。在KLF9過表達(dá)的OVCAR3細(xì)胞,也觀察到了Cyclin D1的高表達(dá)。而在KLF9干擾表達(dá)的兩種卵巢癌細(xì)胞中,Cyclin D1的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)。因此,KLF9可能通過上調(diào)Cyclin D1的表達(dá),明顯逆轉(zhuǎn)了KLF9對卵巢癌細(xì)胞活力和增殖的影響。因此,KLF9的生物學(xué)功能依賴Cyclin D1基因。4. Cyclin D1干擾表達(dá)可逆轉(zhuǎn)KLF9的作用。KLF9過表達(dá)后,促進(jìn)了該啟動子的活性。5.KLF9調(diào)控Cyclin D1的分子機(jī)制為結(jié)合在cyclinD1的結(jié)合位點(diǎn)。分析了啟動子的300個堿基。從中發(fā)現(xiàn)：-267bp處有一個可能的KLF結(jié)合位點(diǎn)。通過構(gòu)建該位點(diǎn)的堿基突變質(zhì)粒,表明：KLF9顯著增加野生型Cyclin D1啟動子的活性,而對堿基突變后的啟動子無顯著影響。進(jìn)一步,染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)：KLF9可以同該段啟動子直接結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)了Cyclin D1 mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。6.干擾KLF9表達(dá)顯著抑制裸鼠體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞的生長。觀察小鼠的成瘤情況。KLF9干擾表達(dá)組,腫瘤直徑、容積和重量均顯著小于對照組。與此對應(yīng)的是,KLF9干擾表達(dá)組腫瘤細(xì)胞Cyclin D1的mRNA和蛋白水平顯著下調(diào),進(jìn)一步證實(shí)Cyclin D1是KLF9的下游靶基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：1.KLF9過表達(dá)后,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的活力和增殖,加快細(xì)胞周期進(jìn)程。2.KLF9干擾表達(dá)后,抑制卵巢癌細(xì)胞的活力和增殖,阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。3.KLF9通過結(jié)合在Cyclin D1基因的啟動子上,促進(jìn)Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。4.干擾Cyclin D1基因的表達(dá)后,顯著抑制KLF9促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。5.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：KLF9在體內(nèi)具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、腫瘤生長的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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2 Ferenc Sipos;Miklós Constantinovits;Gy銉rgyi Müzes;;Intratumoral functional heterogeneity and chemotherapy[J];World Journal of Gastroenterology;2014年10期

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本文編號：1156607