本文關(guān)鍵詞：TFEB介導(dǎo)的自噬在胃癌耐藥中的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：【背景】據(jù)2012年Gl OBOCAN全球腫瘤統(tǒng)計,全球每年42.5%新發(fā)胃癌病例來自我國。45.0%胃癌病死人數(shù)來自我國。因此,胃癌對人類健康,尤其是國人健康存在極大的威脅。大多數(shù)胃癌患者對胃癌了解不足,缺少定期胃鏡檢查,在確診時已處于中晚期,失去手術(shù)機(jī)會,化療成為防止胃癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要治療措施之一。然而,耐藥現(xiàn)象(Drug resistance)常常導(dǎo)致胃癌患者有藥無用,甚至無藥可用,最終導(dǎo)致化療失敗,預(yù)后極差。國內(nèi)外研究同行及我們的多項研究已經(jīng)初步闡明了胃癌耐藥的多種相關(guān)機(jī)制,然而胃癌耐藥產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜,其根本機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。因此,從新的角度闡明胃癌耐藥的機(jī)制可為胃癌耐藥研究提供新的思路。自噬(Autophagy)是細(xì)胞通過消化自身,清除胞內(nèi)受損蛋白和細(xì)胞器的重要機(jī)制,與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有不可分割的聯(lián)系。有部分研究認(rèn)為自噬能夠通過自噬性死亡抑制腫瘤發(fā)生,然而越來越多的研究提示自噬能夠被腫瘤細(xì)胞利用,成為腫瘤在各種惡劣情況下存活的重要方式。那么,化療藥物能否誘導(dǎo)自噬發(fā)生,化療藥物作用情況下,自噬能否促進(jìn)胃癌細(xì)胞的存活,什么關(guān)鍵分子或者通路在其中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用?其調(diào)控機(jī)制如何?既往研究發(fā)現(xiàn)m TOR是自噬調(diào)控的關(guān)鍵通路,尤其是m TORC1下游的轉(zhuǎn)錄因子TFEB是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控自噬的關(guān)鍵分子,其調(diào)控的細(xì)胞自噬在脂質(zhì)代謝紊亂、帕金森等多種代謝蓄積性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。然而,TFEB在腫瘤中所扮演的角色尚不明確。那么,TFEB是否參與胃癌惡性表型,尤其是胃癌耐藥?TFEB是否通過調(diào)控胃癌細(xì)胞自噬促進(jìn)胃癌耐藥?其機(jī)制如何?目前尚不明確�！灸康摹�1、明確在化療情況下,自噬水平的變化情況及其對胃癌細(xì)胞存活的作用;2、探討化療情況下,自噬關(guān)鍵分子信號通路m TORC1/TFEB的變化情況;3、闡明自噬關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子TFEB在胃癌耐藥中的關(guān)鍵作用及其調(diào)控機(jī)制�！痉椒ā�1、利用western blot、MDC染色、RFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染、電鏡等方法在體外檢測化療情況下胃癌細(xì)胞自噬水平的變化;2、利用免疫組化檢測LC3,觀察化療藥物對裸鼠成瘤瘤體的自噬水平的影響;3、利用MTT藥敏實驗、凋亡檢測等方法在體外驗證化療情況下自噬對胃癌細(xì)胞存活的作用;4、利用裸鼠成瘤實驗在體內(nèi)驗證化療情況下自噬對胃癌細(xì)胞存活的作用;5、利用western blot、免疫熒光方法觀察自噬關(guān)鍵通路m TORC1/TFEB信號通路的變化;6、利用免疫組化觀察轉(zhuǎn)錄因子TFEB在胃癌中的表達(dá)情況和亞細(xì)胞分布;7、運用MTT藥敏實驗、凋亡、高內(nèi)涵分析等相關(guān)分子生物學(xué)檢測技術(shù),研究TFEB通過調(diào)控其下游靶基因Lamp1等分子,促進(jìn)胃癌細(xì)胞在化療情況下存活的關(guān)鍵作用及調(diào)控機(jī)制�！窘Y(jié)果】1、自噬是胃癌細(xì)胞在化療藥物作用情況下的一種重要存活機(jī)制(1)化療藥物EPI和CIS能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬化療藥物表柔霉素(EPI)和順鉑(CIS)能夠誘導(dǎo)LC3II表達(dá)增高,并促進(jìn)p62的降解;而具有溶酶體抑制作用的抗瘧疾藥物氯喹(CQ)、液泡型ATP酶抑制劑BAF能夠抑制EPI誘導(dǎo)的自噬流。MDC染色結(jié)果顯示EPI能夠使酸性囊泡增加;RFP-GFP-LC3腺病毒感染后,免疫熒光結(jié)果顯示EPI能夠自噬體(RFP+GFP+)明顯增加,溶酶體抑制劑CQ能夠促進(jìn)EPI誘導(dǎo)的自噬體增加;電鏡顯示EPI能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的生成;體內(nèi)實驗也表明,腹腔注射EPI能夠使裸鼠荷瘤的瘤體LC3表達(dá)增高。(2)抑制自噬能夠提高胃癌細(xì)胞對化療藥物EPI和CIS的敏感性MTT結(jié)果顯示,利用溶酶體抑制劑CQ抑制胃癌細(xì)胞的自噬作用,能夠增加胃癌細(xì)胞對EPI和CIS的敏感性;凋亡實驗顯示聯(lián)用CQ+EPI能夠顯著增加EPI誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實驗表明CQ+EPI聯(lián)用能夠明顯降低裸鼠荷瘤瘤體的體積和重量。2、mTORC1/TFEB調(diào)控通路是化療藥物誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路(1)化療藥物能夠抑制mTORC1EPI和CIS能夠以時間依賴的方式抑制m TOR分子Ser2448位點的磷酸化;與此一致,m TORC1下游的p70S6K分子Thr389位點的磷酸化也明顯受到抑制;(2)化療藥物能夠誘導(dǎo)m TORC1下游轉(zhuǎn)錄因子TFEB入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用Western blot顯示EPI能夠以時間依賴的方式促進(jìn)TFEB的去磷酸化;免疫熒光顯示EPI能夠誘導(dǎo)TFEB發(fā)生核轉(zhuǎn)位;通過分離核漿蛋白,我們發(fā)現(xiàn)隨著EPI處理時間的延長,胞漿定位的TFEB表達(dá)逐漸降低,而胞核定位的TFEB表達(dá)逐漸增加;免疫共沉淀顯示m TOR、Raptor、YWHA在正常情況下能夠與TFEB結(jié)合,而EPI作用下與TFEB的結(jié)合能力逐漸減弱。(3)免疫組化結(jié)果顯示胃癌組織中TFEB表達(dá)明顯比癌旁組織增高,且主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞的胞核中,并與胃癌的不良預(yù)后相關(guān);3、TFEB通過調(diào)控自噬和Lamp1介導(dǎo)的溶酶體功能,促進(jìn)胃癌細(xì)胞的存活(1)過表達(dá)TFEB能夠自噬發(fā)生和溶酶體生成,促進(jìn)胃癌細(xì)胞的存活MTT結(jié)果和凋亡實驗證實過表達(dá)TFEB及其S11A突變體能夠降低化療藥物EPI誘導(dǎo)的凋亡,促進(jìn)胃癌細(xì)胞存活。TFEB能夠促進(jìn)自噬,并轉(zhuǎn)錄激活Lamp1等溶酶體相關(guān)分子表達(dá)。(2)干擾TFEB表達(dá)能夠抑制化療藥物誘導(dǎo)的自噬,提高化療敏感性抑制TFEB在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)能夠胃癌細(xì)胞的化療敏感性;抑制TFEB表達(dá)能夠明顯抑制EPI介導(dǎo)的LC3 II增高和p62降解;同時明顯抑制EPI介導(dǎo)的細(xì)胞中的平均Lysotracker數(shù)目增加;在胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞7901/ADR中抑制TFEB的表達(dá)能夠顯著提高其藥物敏感性;(3)TFEB通過調(diào)控Lamp1介導(dǎo)的溶酶體功能,促進(jìn)胃癌細(xì)胞對化療的抵抗MTT結(jié)果和凋亡實驗證實抑制Lamp1能夠顯著增加胃癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。Western blot和免疫熒光結(jié)果抑制Lamp1能夠反饋性促進(jìn)EPI誘導(dǎo)的TFEB核轉(zhuǎn)位�！窘Y(jié)論】本研究發(fā)現(xiàn)自噬對化療情況下胃癌細(xì)胞的存活具有重要保護(hù)作用,抑制自噬能夠增加胃癌的化療效果;m TORC1/TFEB通路是調(diào)控自噬的重要通路,是化療藥物相關(guān)自噬的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑。TFEB作為m TOR下游的重要的自噬轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)因子,在胃癌組織中表達(dá)明顯升高,且主要表達(dá)于胞核,其表達(dá)水平與胃癌預(yù)后密切相關(guān);化療藥物EPI和CIS等通過抑制m TORC1,促進(jìn)TFEB發(fā)生去磷酸化,去磷酸化的TFEB能夠發(fā)生核轉(zhuǎn)位并發(fā)揮其調(diào)控自噬與溶酶體生成的轉(zhuǎn)錄活性。TFEB通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控自噬和Lamp1介導(dǎo)的溶酶體功能,促進(jìn)胃癌細(xì)胞在化療情況下的存活。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
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本文編號：1156582