本文關(guān)鍵詞：基于全基因組測序及外顯子組測序的食管癌相關(guān)基因篩選及功能鑒定

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【摘要】：目的從基因組學水平系統(tǒng)分析與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的單核苷酸變異、拷貝數(shù)擴增/缺失及結(jié)構(gòu)變異等各類遺傳變異,繪制相應(yīng)的食管癌基因組圖譜及食管癌相關(guān)基因變異圖譜,探索與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的驅(qū)動基因及相應(yīng)信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò);并在此基礎(chǔ)上,對興趣目的基因進行相應(yīng)的生物學功能驗證,研究目的基因在食管癌細胞與正常食管粘膜上皮細胞中的表達差異;明確目的基因野生型與突變體的定位是否有區(qū)別;探討沉默及過表達目的基因?qū)κ彻馨┘毎鲋�、侵襲及遷移能力的影響;并初步探討其在食管鱗癌中的作用機制。方法:1、收集104例食管鱗癌患者的癌組織及配對癌旁正常組織樣本,提取基因組DNA,14例進行全基因組測序,90例進行外顯子組測序,對測序結(jié)果進行目標區(qū)域捕獲測序驗證。應(yīng)用生物信息學方法分析各類遺傳變異,鑒定與食管鱗癌發(fā)生密切相關(guān)的顯著突變基因及富集的信號通路,并進行Ⅰ、Ⅲ期差異比較分析。2、采用PCR sanger測序驗證組學測序結(jié)果中ZNF750基因的突變位點;采用q-PCR分別驗證及檢測ZNF750在3例全基因組測序樣本及6例外顯子組突變樣本中的拷貝數(shù)情況。3、采用基于組織芯片的免疫組織化學技術(shù)研究食管鱗癌組織及正常食管粘膜組織中ZNF750蛋白表達量及表達部位的差異。4、應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測野生型ZNF750與S70X突變體的細胞內(nèi)定位。5、(1)在內(nèi)源性高表達ZNF750的KYSE150及KYSE140食管癌細胞中轉(zhuǎn)染p LKO.1-puro-sh RNA-ZNF750載體,敲低內(nèi)源性ZNF750,通過MTT實驗、RTCA細胞實時分析實驗、平板克隆形成實驗在細胞水平觀察該基因的敲低對食管鱗癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響。(2)將ZNF750敲低前后的KYSE150細胞分別接種于裸鼠皮下,接種3-4周后觀察和記錄腫瘤形成數(shù)量和形成體積,在動物水平觀察該基因的敲低對食管鱗癌細胞生物學特性的影響。6、將ZNF750的過表達載體轉(zhuǎn)染內(nèi)源性ZNF750低表達的K2細胞株,Western blot驗證過表達效率;通過MTT實驗、平板克隆形成實驗及Transwell小室在細胞水平驗證該基因的過表達對食管鱗癌細胞生物學功能的影響。7、采用Western blot方法觀察ZNF750敲低前后的食管鱗癌細胞株以及裸鼠移植瘤的腫瘤樣本中ZNF750已知的下游靶基因的表達情況,初步探討ZNF750在ESCC中的作用機制。結(jié)果:1、基因編碼區(qū)的變異分析發(fā)現(xiàn)了10330個突變事件,其中有10056個SNVs(67%為錯義突變,6%為無義突變)、90個In Dels(84%為移碼突變,16%為非移碼突變)及184個位于剪切位點的變異;總共發(fā)生非沉默突變事件7597次。2、14例全基因組測序及90例外顯子組測序中位于基因編碼區(qū)的體細胞突變堿基替換類型以CT的轉(zhuǎn)換為主,其次為CG的顛換。生物信息學方法的聚類分析鑒定了3種“突變頻譜印跡”(mutational signatures)。3、運用Mut Sig排除基因長度、背景突變率的影響,并通過整合突變異質(zhì)性,鑒定出8個可能與食管鱗癌相關(guān)的顯著突變基因及14條食管鱗癌顯著相關(guān)的信號通路。其中,ZNF750是新的食管鱗癌相關(guān)的顯著突變基因(P0.0001,FDR0.178),其在組學測序中的突變64%為失活突變,且在3例全基因組測序樣本中存在明顯的拷貝數(shù)缺失(21%,G score0.23)。4、組學測序結(jié)果顯示NOTCH1基因在Ⅰ、Ⅲ期的突變頻率分別為35%、8%,其突變頻率在Ⅰ、Ⅲ期之間有顯著差異(P0.0001)。同時,鑒定出Ⅰ、Ⅲ期突變頻率有顯著差異的7條信號通路。5、拷貝數(shù)變異分析發(fā)現(xiàn),在染色體臂水平,拷貝數(shù)缺失主要位于4p、11p、16p、19p、19q;拷貝數(shù)擴增主要位于3q、5p、7p、7q、8p、8q、12p、14q、18p、20q、21q、Xp、Xq。應(yīng)用GISTIC分析,得出126個拷貝數(shù)顯著變化的區(qū)域。6、應(yīng)用CREST進行結(jié)構(gòu)變異分析,我們發(fā)現(xiàn)了988次結(jié)構(gòu)變異事件,其中染色體間的結(jié)構(gòu)變異257次,染色體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變異296次,大片段的拷貝數(shù)缺失27次,大片段的插入163次,倒位2次。7、組學測序結(jié)果中ZNF750基因的6個突變位點中有5個突變位點成功驗證,其中1個突變位點通過IGV的手工檢測確定其為陽性結(jié)果;3例全基因組測序樣本中的ZNF750拷貝數(shù)缺失均驗證成功,6例ZNF750突變病例經(jīng)q PCR驗證有4例存在拷貝數(shù)缺失。8、腫瘤組織中胞漿ZNF750蛋白的表達量顯著高于癌旁正常組織,而腫瘤組織中胞核ZNF750蛋白的表達量顯著低于癌旁正常組織(P0.0001)。9、野生型ZNF750蛋白主要定位于細胞核;而S70X突變體定位于胞漿。10、(1)KYSE150及KYSE140細胞中ZNF750的敲低明顯促進了癌細胞的增殖、侵襲及遷移(P0.05);(2)裸鼠移植瘤實驗顯示ZNF750敲低組的腫瘤形成率及腫瘤形成體積均明顯高于對照組(P0.05)。11、K2中ZNF750基因的過表達明顯抑制癌細胞的增殖、侵襲及遷移(P0.05),驗證了ZNF750在食管鱗癌中腫瘤抑制基因的作用。12、KYSE150及KYSE140食管鱗癌細胞中ZNF750的敲低降低了KLF4的蛋白表達水平;ZNF750敲低組的裸鼠移植瘤的腫瘤樣本中KLF4的表達水平與對照組相比,亦明顯降低。結(jié)論:1、利用全基因組測序及外顯子組測序篩選出了食管鱗癌相關(guān)的各類遺傳變異,包括單核苷酸變異、拷貝數(shù)擴增/缺失及結(jié)構(gòu)變異,應(yīng)用目標區(qū)域捕獲測序進行了相應(yīng)的驗證;篩選出ZNF750基因在食管鱗癌存在顯著的失活突變及拷貝數(shù)缺失,其可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2、ZNF750基因可能是與食管鱗狀細胞癌發(fā)生密切相關(guān)的新的腫瘤抑制基因,其抑制食管癌細胞增殖、侵襲、遷移的作用可能通過KLF4實現(xiàn)
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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1 齊義軍;王立東;焦新英;馮笑山;范宗民;高珊珊;何欣;李吉林;常扶保;;河南食管癌高發(fā)區(qū)食管癌及癌旁組織AnnexinⅡ表達失調(diào)變化[J];癌癥;2007年07期

2 An-Hui Wang;Yuan Liu;Bo Wang;Yi-Xuan He;Ye-Xian Fang;Yong-Ping Yan;;Epidemiological studies of esophageal cancer in the era of genome-wide association studies[J];World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology;2014年03期

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本文編號：1156287