發(fā)布時(shí)間：2017-11-08 08:06

  本文關(guān)鍵詞：基于全基因組測(cè)序及外顯子組測(cè)序的食管癌相關(guān)基因篩選及功能鑒定

  更多相關(guān)文章： 食管癌 全基因組測(cè)序 外顯子組測(cè)序 ZNF750 KLF4

【摘要】：目的從基因組學(xué)水平系統(tǒng)分析與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的單核苷酸變異、拷貝數(shù)擴(kuò)增/缺失及結(jié)構(gòu)變異等各類(lèi)遺傳變異,繪制相應(yīng)的食管癌基因組圖譜及食管癌相關(guān)基因變異圖譜,探索與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的驅(qū)動(dòng)基因及相應(yīng)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò);并在此基礎(chǔ)上,對(duì)興趣目的基因進(jìn)行相應(yīng)的生物學(xué)功能驗(yàn)證,研究目的基因在食管癌細(xì)胞與正常食管粘膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)差異;明確目的基因野生型與突變體的定位是否有區(qū)別;探討沉默及過(guò)表達(dá)目的基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響;并初步探討其在食管鱗癌中的作用機(jī)制。方法:1、收集104例食管鱗癌患者的癌組織及配對(duì)癌旁正常組織樣本,提取基因組DNA,14例進(jìn)行全基因組測(cè)序,90例進(jìn)行外顯子組測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序驗(yàn)證。應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析各類(lèi)遺傳變異,鑒定與食管鱗癌發(fā)生密切相關(guān)的顯著突變基因及富集的信號(hào)通路,并進(jìn)行Ⅰ、Ⅲ期差異比較分析。2、采用PCR sanger測(cè)序驗(yàn)證組學(xué)測(cè)序結(jié)果中ZNF750基因的突變位點(diǎn);采用q-PCR分別驗(yàn)證及檢測(cè)ZNF750在3例全基因組測(cè)序樣本及6例外顯子組突變樣本中的拷貝數(shù)情況。3、采用基于組織芯片的免疫組織化學(xué)技術(shù)研究食管鱗癌組織及正常食管粘膜組織中ZNF750蛋白表達(dá)量及表達(dá)部位的差異。4、應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)野生型ZNF750與S70X突變體的細(xì)胞內(nèi)定位。5、(1)在內(nèi)源性高表達(dá)ZNF750的KYSE150及KYSE140食管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p LKO.1-puro-sh RNA-ZNF750載體,敲低內(nèi)源性ZNF750,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、RTCA細(xì)胞實(shí)時(shí)分析實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平觀(guān)察該基因的敲低對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響。(2)將ZNF750敲低前后的KYSE150細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下,接種3-4周后觀(guān)察和記錄腫瘤形成數(shù)量和形成體積,在動(dòng)物水平觀(guān)察該基因的敲低對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。6、將ZNF750的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染內(nèi)源性ZNF750低表達(dá)的K2細(xì)胞株,Western blot驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效率;通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及Transwell小室在細(xì)胞水平驗(yàn)證該基因的過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。7、采用Western blot方法觀(guān)察ZNF750敲低前后的食管鱗癌細(xì)胞株以及裸鼠移植瘤的腫瘤樣本中ZNF750已知的下游靶基因的表達(dá)情況,初步探討ZNF750在ESCC中的作用機(jī)制。結(jié)果:1、基因編碼區(qū)的變異分析發(fā)現(xiàn)了10330個(gè)突變事件,其中有10056個(gè)SNVs(67%為錯(cuò)義突變,6%為無(wú)義突變)、90個(gè)In Dels(84%為移碼突變,16%為非移碼突變)及184個(gè)位于剪切位點(diǎn)的變異;總共發(fā)生非沉默突變事件7597次。2、14例全基因組測(cè)序及90例外顯子組測(cè)序中位于基因編碼區(qū)的體細(xì)胞突變堿基替換類(lèi)型以CT的轉(zhuǎn)換為主,其次為CG的顛換。生物信息學(xué)方法的聚類(lèi)分析鑒定了3種“突變頻譜印跡”(mutational signatures)。3、運(yùn)用Mut Sig排除基因長(zhǎng)度、背景突變率的影響,并通過(guò)整合突變異質(zhì)性,鑒定出8個(gè)可能與食管鱗癌相關(guān)的顯著突變基因及14條食管鱗癌顯著相關(guān)的信號(hào)通路。其中,ZNF750是新的食管鱗癌相關(guān)的顯著突變基因(P0.0001,FDR0.178),其在組學(xué)測(cè)序中的突變64%為失活突變,且在3例全基因組測(cè)序樣本中存在明顯的拷貝數(shù)缺失(21%,G score0.23)。4、組學(xué)測(cè)序結(jié)果顯示NOTCH1基因在Ⅰ、Ⅲ期的突變頻率分別為35%、8%,其突變頻率在Ⅰ、Ⅲ期之間有顯著差異(P0.0001)。同時(shí),鑒定出Ⅰ、Ⅲ期突變頻率有顯著差異的7條信號(hào)通路。5、拷貝數(shù)變異分析發(fā)現(xiàn),在染色體臂水平,拷貝數(shù)缺失主要位于4p、11p、16p、19p、19q;拷貝數(shù)擴(kuò)增主要位于3q、5p、7p、7q、8p、8q、12p、14q、18p、20q、21q、Xp、Xq。應(yīng)用GISTIC分析,得出126個(gè)拷貝數(shù)顯著變化的區(qū)域。6、應(yīng)用CREST進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異分析,我們發(fā)現(xiàn)了988次結(jié)構(gòu)變異事件,其中染色體間的結(jié)構(gòu)變異257次,染色體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變異296次,大片段的拷貝數(shù)缺失27次,大片段的插入163次,倒位2次。7、組學(xué)測(cè)序結(jié)果中ZNF750基因的6個(gè)突變位點(diǎn)中有5個(gè)突變位點(diǎn)成功驗(yàn)證,其中1個(gè)突變位點(diǎn)通過(guò)IGV的手工檢測(cè)確定其為陽(yáng)性結(jié)果;3例全基因組測(cè)序樣本中的ZNF750拷貝數(shù)缺失均驗(yàn)證成功,6例ZNF750突變病例經(jīng)q PCR驗(yàn)證有4例存在拷貝數(shù)缺失。8、腫瘤組織中胞漿ZNF750蛋白的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織,而腫瘤組織中胞核ZNF750蛋白的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織(P0.0001)。9、野生型ZNF750蛋白主要定位于細(xì)胞核;而S70X突變體定位于胞漿。10、(1)KYSE150及KYSE140細(xì)胞中ZNF750的敲低明顯促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移(P0.05);(2)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示ZNF750敲低組的腫瘤形成率及腫瘤形成體積均明顯高于對(duì)照組(P0.05)。11、K2中ZNF750基因的過(guò)表達(dá)明顯抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移(P0.05),驗(yàn)證了ZNF750在食管鱗癌中腫瘤抑制基因的作用。12、KYSE150及KYSE140食管鱗癌細(xì)胞中ZNF750的敲低降低了KLF4的蛋白表達(dá)水平;ZNF750敲低組的裸鼠移植瘤的腫瘤樣本中KLF4的表達(dá)水平與對(duì)照組相比,亦明顯降低。結(jié)論:1、利用全基因組測(cè)序及外顯子組測(cè)序篩選出了食管鱗癌相關(guān)的各類(lèi)遺傳變異,包括單核苷酸變異、拷貝數(shù)擴(kuò)增/缺失及結(jié)構(gòu)變異,應(yīng)用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序進(jìn)行了相應(yīng)的驗(yàn)證;篩選出ZNF750基因在食管鱗癌存在顯著的失活突變及拷貝數(shù)缺失,其可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2、ZNF750基因可能是與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生密切相關(guān)的新的腫瘤抑制基因,其抑制食管癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的作用可能通過(guò)KLF4實(shí)現(xiàn)
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 齊義軍;王立東;焦新英;馮笑山;范宗民;高珊珊;何欣;李吉林;常扶保;;河南食管癌高發(fā)區(qū)食管癌及癌旁組織AnnexinⅡ表達(dá)失調(diào)變化[J];癌癥;2007年07期

2 An-Hui Wang;Yuan Liu;Bo Wang;Yi-Xuan He;Ye-Xian Fang;Yong-Ping Yan;;Epidemiological studies of esophageal cancer in the era of genome-wide association studies[J];World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology;2014年03期

，

本文編號(hào)：1156287