本文關(guān)鍵詞：脂肪干細(xì)胞載荷的靜電紡絲納米纖維膜層層組裝構(gòu)建的三維支架修復(fù)顱骨缺損的研究

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【摘要】：骨缺損是臨床治療過程中常見的疾病,小的骨缺損可以通過骨組織的自身再生進(jìn)行修復(fù),但當(dāng)骨缺損超過骨再生能力時,常致骨不愈合,嚴(yán)重影響相應(yīng)肢體功能。所以較大的骨缺損常常是臨床上治療的難點。骨缺損傳統(tǒng)的治療方法有自體骨移植、同種異體骨移植等,但由于其來源有限及免疫反應(yīng)等問題而無法廣泛用于骨缺損尤其是大范圍的骨缺損。骨組織工程的方法為骨缺損的治療提供了新的思路及方法,利用骨組織工程所構(gòu)建的骨組織治療骨缺損是目前研究的熱點。目前骨組織工程的研究主要集中于生物支架材料、種子細(xì)胞及因子的研究。層層組裝的三維支架構(gòu)建技術(shù)是將生物材料層層疊加組裝,將現(xiàn)有的二維平面結(jié)構(gòu)構(gòu)建成有助于細(xì)胞生長的三維結(jié)構(gòu)的方法。層層組裝的方法可以構(gòu)建與機(jī)體內(nèi)環(huán)境相似的三維結(jié)構(gòu),從而增加細(xì)胞與支架,細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系。該結(jié)構(gòu)能夠為細(xì)胞生長提供化學(xué)濃度梯度,為細(xì)胞生長提供其必需的物質(zhì)及空間。同時通過改變每層膜結(jié)構(gòu),更換種植的細(xì)胞,層層組裝技術(shù)可以將納米纖維膜構(gòu)建成具有多種功能的三維支架。靜電紡絲技術(shù)是利用高壓電場作用下使聚合物形成穩(wěn)定的納米纖維而構(gòu)建支架的技術(shù),其近年來迅速發(fā)展并應(yīng)用于組織工程,由于其產(chǎn)生的纖維直徑小,大部分為納米級別,遠(yuǎn)小于細(xì)胞直徑大小,而且該類納米級別的纖維與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似,所以目前靜電紡絲材料常用于構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)或組織工程支架。聚已內(nèi)酯(PCL)具有良好的機(jī)械性能,且具有良好的生物相容性。明膠(gelatin)具有良好的生物相容性及細(xì)胞粘附性。兩者相結(jié)合可以使構(gòu)建的結(jié)構(gòu)具有一定的機(jī)械性能并能具有良好的細(xì)胞粘附效果,使其更有利于組織工程支架的構(gòu)建。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)是目前種子細(xì)胞研究的熱點,該間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新及增殖分化能力,是具有向多個方向分化潛能的多能干細(xì)胞,在一定條件下,其能增殖分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。同時由于其具有來源豐富、取材操作簡單、培養(yǎng)方便以及不涉及倫理道德問題等優(yōu)點,ADSCs是目前應(yīng)用最有前景的干細(xì)胞。本研究以PCL及gelatin為原料,利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建了靜電紡絲納米纖維膜,所得到的靜電紡絲膜具有孔隙率大、纖維均勻、纖維直徑小至納米級、具有較好的機(jī)械性能及生物相容性等特點。我們將ADSCs種植于PCL/gelatin靜電紡絲納米纖維膜(nanofibrous membrane, NFM)上,檢測了該NFM的細(xì)胞相容性及細(xì)胞在NFM上生長的增殖情況,結(jié)果顯示該NFM具有很好的生物相容性,細(xì)胞在膜上粘附好,能正常生長增殖。應(yīng)用ADSCs載荷的NFM進(jìn)行層層組裝構(gòu)建了ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架結(jié)構(gòu),并檢測該支架結(jié)構(gòu)內(nèi)ADSCs存活情況,細(xì)胞Live/Dea d染色結(jié)果示,該支架內(nèi)的ADSCs能大部分成活,細(xì)胞增殖試驗結(jié)果顯示ADSCs在NFM層層組裝三維支架結(jié)構(gòu)內(nèi)能顯著增殖,開始12小時內(nèi)其與對照組相比低少許,但培養(yǎng)24小時后其增殖明顯高于對照組。將該ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架進(jìn)行培養(yǎng),檢測該支架內(nèi)ADSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)情況,結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架結(jié)構(gòu)組具有最好的成骨分化效果,成骨相關(guān)基因表達(dá)量較其他組高。將ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架結(jié)構(gòu)種植于大鼠顱骨缺損處以檢測該支架結(jié)構(gòu)修復(fù)顱骨缺損的效果,大體標(biāo)本、micro-CT結(jié)果及組織切片結(jié)果均顯示ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架結(jié)構(gòu)具有很好的成骨及修復(fù)骨缺損的能力。第1章大鼠腹股溝皮下脂肪來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定及成骨效果研究目的：對大鼠腹股溝皮下脂肪來源的ADSCs進(jìn)行鑒定,明確所獲得的ADSCs的純度,并對ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),明確大鼠腹股溝部脂肪來源的ADSCs的成骨效果。方法：3只2個月大小,平均體重為227g±14.8g的SD大鼠(購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心),經(jīng)腹腔注射麻醉后,常規(guī)手術(shù)操作切取大鼠腹股溝皮下脂肪組織。對脂肪組織進(jìn)行剪切、消化、提取ADSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)。所得ADSCs進(jìn)行以下檢測： (1)顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察； (2)第4代的ADSCs應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD29、CD90、CD49d、CD45、CDllb及CD106各表面標(biāo)志物,對ADSCs進(jìn)行鑒定,并確定其純度； (3)對所獲得的ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),應(yīng)用堿性磷酸酶(ALP)染色及Alizarin red (茜素紅)染色檢測其成骨分化能力。結(jié)果： (1)顯微鏡下ADSCs大小約50-100 μm,細(xì)胞較大,核大居中,胞漿豐富,細(xì)胞呈多角形,細(xì)胞長長融合后呈梭形漩渦狀排列。 (2)ADSCs的流式細(xì)胞術(shù)檢測：特征性表面抗體陽性率為CD29 (99.65%), CD90 (68.38%)及CD49d (86.82%), ADSCs非特征性抗體的陽性率：CD45(0.06%),CD11b (0.24%) 及 CD106 (0.84%). (3)ALP染色結(jié)果示：成骨誘導(dǎo)后的ADSCs染成灰色,結(jié)果陽性。茜素紅染色結(jié)果顯示：ADSCs大范圍紅染,視野內(nèi)可見多量呈紅色深染的礦化結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)散在分布,中心部顏色較深。結(jié)論： (1)AADSCs來源豐富、容易獲得、取材簡單,易于培養(yǎng),無需特殊培養(yǎng)條件,這均為其應(yīng)用提供了有利條件； (2)我們提取的大鼠腹股溝皮下ADSCs的形態(tài)及表型符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征； (3)我們所提取的大鼠腹股溝皮下AADSCs純度較高,可應(yīng)用于組織工程的研究； (4)大鼠腹股溝皮下ADSCs具有良好的成骨分化功能。第2章靜電紡絲納米纖維膜支架的構(gòu)建、生物特性檢測及其體外促進(jìn)ADSCs成骨分化的效果目的：本研究應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建靜電紡絲納米纖維膜,檢測其生物相容性及細(xì)胞在膜上的增殖及成骨分化情況,應(yīng)用納米纖維膜層層組裝構(gòu)建三維支架,檢測ADSCs在該三維支架內(nèi)的成骨效果。方法：本研究以PCL及gelatin為材料,分別以10%濃度溶于三氟乙醇溶劑,然后將兩溶液以1：1比例混合,利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建納米纖維膜(nanofiber membrane, NFM)。(1)對該納米纖維膜的形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察及檢測；(2)將ADSCs種植于NFM上,觀察NFM的生物相容性,并檢測ADSCs在NFM層層組裝的三維支架上的增殖情況,采用析因設(shè)計資料的方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計分析及應(yīng)用兩獨立樣本的t檢驗比較兩組4個時間點增殖的差異； (3)應(yīng)用掃描電鏡觀察NFM的纖維結(jié)構(gòu),并測量其纖維直徑大小,掃描電鏡下觀察細(xì)胞在NFM上的生長情況； (4)應(yīng)用Live/Dead染色技術(shù)以檢測ADSCs在NFM三維支架內(nèi)的存活情況； (5)將AADSCs載荷的NFM膜在體外進(jìn)行成骨誘導(dǎo),進(jìn)行成骨相關(guān)蛋白的熒光染色,檢測成骨相關(guān)蛋白即骨鈣蛋白(osteocalcin, OCN)、骨橋蛋白(osteopotin, OPN)與骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)的表達(dá)情況； (6)將ADSCs載荷的NFM膜進(jìn)層層組裝,然后按(5)所示的方法進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo),檢測ADSCs載荷的NFM層層組裝的三維支架各成骨相關(guān)基因(OCN、OPN、OPG、BSP、RUNX2及OSX)的表達(dá)情況,應(yīng)用單因素方差分析及獨立樣本的t檢驗等統(tǒng)計方法對各組進(jìn)行比較,單樣本與對照組比較時采用單樣本t檢驗,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。評價該層層組裝三維支架結(jié)構(gòu)對成骨的影響。如無特殊說明,每次實驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),每個樣品至少重復(fù)測量3次。結(jié)果： (1)形態(tài)學(xué)觀察：NFM厚度約為50μm,具有一定的機(jī)械性能；(2)掃描電鏡下觀察可見NFM纖維直徑總體均勻,少部分纖維直徑相差懸殊,纖維直徑大約是500-1500nm,納米纖維相互交錯,呈不同立體結(jié)構(gòu),纖維間有大小約10-50-tm左右的孔隙,孔隙間相通。NFM上可見ADSCs生長,細(xì)胞伸展,呈多角形,細(xì)胞與纖維之間聯(lián)系緊密,有些兩者融合,細(xì)胞胞體能部分長入納米纖維膜的孔隙內(nèi)。(3)ADSCs能在NFM上快速增殖,于24小時時間點后顯著高于對照組(t48h=-7.723,P48h=0.002；t72h=-14.912,P72h0.001,F分 組=1451.881,P分組0.00.,F時間=69.878,P時間0.001。交互效應(yīng)：F=48.482,P0.001) (4)ADSCs種植于NFM上后,2周及4周時間點時,對樣本進(jìn)行免疫熒光染色,2周時結(jié)果顯示細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)OCN.OPN.OPG蛋白均有顯色,示有相應(yīng)蛋白的分泌,但表達(dá)量較低,4周時以上各蛋白表達(dá)量均明顯高于2周時的蛋白分泌量； (5)將ADSCs載荷的NFM進(jìn)行層層組裝(3層)并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),于1、2、3及4周四個時間點分別檢測各組基因表達(dá)情況,結(jié)果示3周及4周時間點時,AADSCs-NFM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組的基因表達(dá)OCN(F3w=54.049, P3w0.001；E4w=60.811,P4w0.001).OPN(F3w=47.975,P3w0.001；F4w=67.588, P4w0.001).OPG(F3w=28.306,P3w=0.001；F4w=151.551,P4w=0.001,). BSP(F3w=84.607,P3w0.001；F4w=216.219,P4w0.001).RUNX2(F3w=10.950, P3w=0.003；F4w=4655.158,P4w0.001)及OSX(F3w=2314.216,P3w0.001; E4w=1405.869,P4w0.001)顯著高于其余各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論： (1)PCL及gelatin所構(gòu)建的NFM生相容性好,細(xì)胞能夠很好的貼附于支架上,細(xì)胞在NFM上生長良好； (2)PCL及gelatin所構(gòu)建的NFM有較大的孔隙率,此結(jié)構(gòu)有助于營養(yǎng)擴(kuò)散及產(chǎn)物排出；其纖維結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)相似,可用作為細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞生長； (3)ADSCs能在NFM上生長良好,在誘導(dǎo)情況下能表達(dá)成骨相關(guān)蛋白(OCN,OPN及OPG); (4)ADSCs載荷NFM構(gòu)建的三維支架結(jié)構(gòu)能促進(jìn)ADSCs向成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)表達(dá)相應(yīng)成骨基因表達(dá),促進(jìn)成骨發(fā)生。第3章ADSCs載荷的NFM層層組裝構(gòu)建的3維支架修復(fù)大鼠顱骨缺損目的：本研究將ADSCs載荷的NFM層層組裝構(gòu)建的3維支架應(yīng)用于修復(fù)大鼠顱骨缺損,明確其在大鼠體內(nèi)的成骨效果。方法： (1)按第二部分所述的方法,將ADSCs種植于NFM上進(jìn)行層層組裝構(gòu)建ADSCs載荷的NFM層層組裝3維支架； (2)將以上3維支架種植于大鼠顱骨缺損部位,術(shù)后12周取材,并對大體標(biāo)本進(jìn)行觀察； (3)應(yīng)用micro-CT方法對以上所有樣本進(jìn)行掃描,明確所有樣品再生骨組織的骨礦物質(zhì)密度,對樣品進(jìn)行三維重建明確骨修復(fù)的情況； (4)應(yīng)用HE染色及Masson染色比較各組樣品骨修復(fù)情況的差異； (5)各組樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測,采用獨立樣本t檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行對比,明確各組在各成骨相關(guān)基面表達(dá)上的差異。結(jié)果： (1)各組樣品大體結(jié)果示：ADSCs載荷的NFM層層組裝修復(fù)組的顱骨缺損樣品表面平整,已無缺損殘留,其對顱骨缺損的修復(fù)效果最好。(2) micro-CT檢查結(jié)果示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復(fù)組的再生骨組織的礦物質(zhì)密度為823.047±47.010mg/cm3,較其他兩組再生骨組織的礦物質(zhì)密度高(缺損組的BMD 58.348±4.435,NFM組的BMD為610.666±51.733,ADSC-NFM組的BMD為823.047±47.010,三者比較F=857.565,P0.001,差異較有顯著統(tǒng)計學(xué)意義)。三維重建結(jié)果示該組的原顱骨缺損區(qū)域已大部分修復(fù),且修復(fù)組織無顯著臺階感。(3)HE染色及Masso n染色結(jié)果均示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復(fù)組生成的骨組織最多,結(jié)構(gòu)與正常骨相似,其修復(fù)效果最好。 (4)各組樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測,各成骨相關(guān)基因表達(dá)示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復(fù)組的成骨基因表達(dá)均高于顱骨缺損組OCN(t=13.355,P=0.006)、OPN (t=22.535, P=0.002)、OPG(t=22.67, P=0.002);BSP (r=24.268,PBSP=0.002)、RUNX2(t=8.510,P=0.014)、OSX (t=12.722,P=0.006)及層層組裝的NFM修復(fù)組即NFM組的OCN(t-7.815,P=0.001)、OPN (t=-10.288,P=0.002)、OPG (t-5.528,P=0.05)、BSP (t=-22.721, P0.001)、RUNX2 (t=-7.053,P=0.001)及OSX (t=-9.441,P=0.001)。結(jié)論： (1)ADSCs可以在NFM層層組裝3D支架上分化促時成骨相關(guān)基因蛋白的表達(dá),促進(jìn)骨的形成； (2)ADSCs載荷的NFM層層組裝的三維支架材料可以用于骨組織工程中骨缺損的修復(fù)： (3)NFM層層組裝3D支架有助于ADSCs向成骨細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.1
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本文編號：1152789