本文關鍵詞：脂肪干細胞載荷的靜電紡絲納米纖維膜層層組裝構建的三維支架修復顱骨缺損的研究

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【摘要】：骨缺損是臨床治療過程中常見的疾病,小的骨缺損可以通過骨組織的自身再生進行修復,但當骨缺損超過骨再生能力時,常致骨不愈合,嚴重影響相應肢體功能。所以較大的骨缺損常常是臨床上治療的難點。骨缺損傳統(tǒng)的治療方法有自體骨移植、同種異體骨移植等,但由于其來源有限及免疫反應等問題而無法廣泛用于骨缺損尤其是大范圍的骨缺損。骨組織工程的方法為骨缺損的治療提供了新的思路及方法,利用骨組織工程所構建的骨組織治療骨缺損是目前研究的熱點。目前骨組織工程的研究主要集中于生物支架材料、種子細胞及因子的研究。層層組裝的三維支架構建技術是將生物材料層層疊加組裝,將現有的二維平面結構構建成有助于細胞生長的三維結構的方法。層層組裝的方法可以構建與機體內環(huán)境相似的三維結構,從而增加細胞與支架,細胞與細胞之間的聯系。該結構能夠為細胞生長提供化學濃度梯度,為細胞生長提供其必需的物質及空間。同時通過改變每層膜結構,更換種植的細胞,層層組裝技術可以將納米纖維膜構建成具有多種功能的三維支架。靜電紡絲技術是利用高壓電場作用下使聚合物形成穩(wěn)定的納米纖維而構建支架的技術,其近年來迅速發(fā)展并應用于組織工程,由于其產生的纖維直徑小,大部分為納米級別,遠小于細胞直徑大小,而且該類納米級別的纖維與細胞外基質結構相似,所以目前靜電紡絲材料常用于構建細胞外基質或組織工程支架。聚已內酯(PCL)具有良好的機械性能,且具有良好的生物相容性。明膠(gelatin)具有良好的生物相容性及細胞粘附性。兩者相結合可以使構建的結構具有一定的機械性能并能具有良好的細胞粘附效果,使其更有利于組織工程支架的構建。脂肪間充質干細胞(ADSCs)是目前種子細胞研究的熱點,該間充質干細胞具有較強的自我更新及增殖分化能力,是具有向多個方向分化潛能的多能干細胞,在一定條件下,其能增殖分化為脂肪細胞、成骨細胞、成纖維細胞、神經細胞、血管內皮細胞等。同時由于其具有來源豐富、取材操作簡單、培養(yǎng)方便以及不涉及倫理道德問題等優(yōu)點,ADSCs是目前應用最有前景的干細胞。本研究以PCL及gelatin為原料,利用靜電紡絲技術構建了靜電紡絲納米纖維膜,所得到的靜電紡絲膜具有孔隙率大、纖維均勻、纖維直徑小至納米級、具有較好的機械性能及生物相容性等特點。我們將ADSCs種植于PCL/gelatin靜電紡絲納米纖維膜(nanofibrous membrane, NFM)上,檢測了該NFM的細胞相容性及細胞在NFM上生長的增殖情況,結果顯示該NFM具有很好的生物相容性,細胞在膜上粘附好,能正常生長增殖。應用ADSCs載荷的NFM進行層層組裝構建了ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架結構,并檢測該支架結構內ADSCs存活情況,細胞Live/Dea d染色結果示,該支架內的ADSCs能大部分成活,細胞增殖試驗結果顯示ADSCs在NFM層層組裝三維支架結構內能顯著增殖,開始12小時內其與對照組相比低少許,但培養(yǎng)24小時后其增殖明顯高于對照組。將該ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架進行培養(yǎng),檢測該支架內ADSCs的成骨相關基因表達情況,結果顯示成骨誘導培養(yǎng)的ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架結構組具有最好的成骨分化效果,成骨相關基因表達量較其他組高。將ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架結構種植于大鼠顱骨缺損處以檢測該支架結構修復顱骨缺損的效果,大體標本、micro-CT結果及組織切片結果均顯示ADSCs載荷的NFM層層組裝三維支架結構具有很好的成骨及修復骨缺損的能力。第1章大鼠腹股溝皮下脂肪來源的脂肪間充質干細胞的鑒定及成骨效果研究目的：對大鼠腹股溝皮下脂肪來源的ADSCs進行鑒定,明確所獲得的ADSCs的純度,并對ADSCs進行成骨誘導培養(yǎng),明確大鼠腹股溝部脂肪來源的ADSCs的成骨效果。方法：3只2個月大小,平均體重為227g±14.8g的SD大鼠(購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心),經腹腔注射麻醉后,常規(guī)手術操作切取大鼠腹股溝皮下脂肪組織。對脂肪組織進行剪切、消化、提取ADSCs進行原代培養(yǎng)。所得ADSCs進行以下檢測： (1)顯微鏡下細胞的形態(tài)學觀察； (2)第4代的ADSCs應用流式細胞術檢測CD29、CD90、CD49d、CD45、CDllb及CD106各表面標志物,對ADSCs進行鑒定,并確定其純度； (3)對所獲得的ADSCs進行成骨誘導培養(yǎng),應用堿性磷酸酶(ALP)染色及Alizarin red (茜素紅)染色檢測其成骨分化能力。結果： (1)顯微鏡下ADSCs大小約50-100 μm,細胞較大,核大居中,胞漿豐富,細胞呈多角形,細胞長長融合后呈梭形漩渦狀排列。 (2)ADSCs的流式細胞術檢測：特征性表面抗體陽性率為CD29 (99.65%), CD90 (68.38%)及CD49d (86.82%), ADSCs非特征性抗體的陽性率：CD45(0.06%),CD11b (0.24%) 及 CD106 (0.84%). (3)ALP染色結果示：成骨誘導后的ADSCs染成灰色,結果陽性。茜素紅染色結果顯示：ADSCs大范圍紅染,視野內可見多量呈紅色深染的礦化結節(jié),結節(jié)散在分布,中心部顏色較深。結論： (1)AADSCs來源豐富、容易獲得、取材簡單,易于培養(yǎng),無需特殊培養(yǎng)條件,這均為其應用提供了有利條件； (2)我們提取的大鼠腹股溝皮下ADSCs的形態(tài)及表型符合間充質干細胞的特征； (3)我們所提取的大鼠腹股溝皮下AADSCs純度較高,可應用于組織工程的研究； (4)大鼠腹股溝皮下ADSCs具有良好的成骨分化功能。第2章靜電紡絲納米纖維膜支架的構建、生物特性檢測及其體外促進ADSCs成骨分化的效果目的：本研究應用靜電紡絲技術構建靜電紡絲納米纖維膜,檢測其生物相容性及細胞在膜上的增殖及成骨分化情況,應用納米纖維膜層層組裝構建三維支架,檢測ADSCs在該三維支架內的成骨效果。方法：本研究以PCL及gelatin為材料,分別以10%濃度溶于三氟乙醇溶劑,然后將兩溶液以1：1比例混合,利用靜電紡絲技術構建納米纖維膜(nanofiber membrane, NFM)。(1)對該納米纖維膜的形態(tài)學進行觀察及檢測；(2)將ADSCs種植于NFM上,觀察NFM的生物相容性,并檢測ADSCs在NFM層層組裝的三維支架上的增殖情況,采用析因設計資料的方差分析方法進行統(tǒng)計分析及應用兩獨立樣本的t檢驗比較兩組4個時間點增殖的差異； (3)應用掃描電鏡觀察NFM的纖維結構,并測量其纖維直徑大小,掃描電鏡下觀察細胞在NFM上的生長情況； (4)應用Live/Dead染色技術以檢測ADSCs在NFM三維支架內的存活情況； (5)將AADSCs載荷的NFM膜在體外進行成骨誘導,進行成骨相關蛋白的熒光染色,檢測成骨相關蛋白即骨鈣蛋白(osteocalcin, OCN)、骨橋蛋白(osteopotin, OPN)與骨保護素(osteoprotegerin, OPG)的表達情況； (6)將ADSCs載荷的NFM膜進層層組裝,然后按(5)所示的方法進行體外成骨誘導,檢測ADSCs載荷的NFM層層組裝的三維支架各成骨相關基因(OCN、OPN、OPG、BSP、RUNX2及OSX)的表達情況,應用單因素方差分析及獨立樣本的t檢驗等統(tǒng)計方法對各組進行比較,單樣本與對照組比較時采用單樣本t檢驗,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。評價該層層組裝三維支架結構對成骨的影響。如無特殊說明,每次實驗進行3次生物學重復,每個樣品至少重復測量3次。結果： (1)形態(tài)學觀察：NFM厚度約為50μm,具有一定的機械性能；(2)掃描電鏡下觀察可見NFM纖維直徑總體均勻,少部分纖維直徑相差懸殊,纖維直徑大約是500-1500nm,納米纖維相互交錯,呈不同立體結構,纖維間有大小約10-50-tm左右的孔隙,孔隙間相通。NFM上可見ADSCs生長,細胞伸展,呈多角形,細胞與纖維之間聯系緊密,有些兩者融合,細胞胞體能部分長入納米纖維膜的孔隙內。(3)ADSCs能在NFM上快速增殖,于24小時時間點后顯著高于對照組(t48h=-7.723,P48h=0.002；t72h=-14.912,P72h0.001,F分 組=1451.881,P分組0.00.,F時間=69.878,P時間0.001。交互效應：F=48.482,P0.001) (4)ADSCs種植于NFM上后,2周及4周時間點時,對樣本進行免疫熒光染色,2周時結果顯示細胞外基質內OCN.OPN.OPG蛋白均有顯色,示有相應蛋白的分泌,但表達量較低,4周時以上各蛋白表達量均明顯高于2周時的蛋白分泌量； (5)將ADSCs載荷的NFM進行層層組裝(3層)并進行成骨誘導培養(yǎng),于1、2、3及4周四個時間點分別檢測各組基因表達情況,結果示3周及4周時間點時,AADSCs-NFM成骨誘導培養(yǎng)基組的基因表達OCN(F3w=54.049, P3w0.001；E4w=60.811,P4w0.001).OPN(F3w=47.975,P3w0.001；F4w=67.588, P4w0.001).OPG(F3w=28.306,P3w=0.001；F4w=151.551,P4w=0.001,). BSP(F3w=84.607,P3w0.001；F4w=216.219,P4w0.001).RUNX2(F3w=10.950, P3w=0.003；F4w=4655.158,P4w0.001)及OSX(F3w=2314.216,P3w0.001; E4w=1405.869,P4w0.001)顯著高于其余各組,差異有統(tǒng)計學意義。結論： (1)PCL及gelatin所構建的NFM生相容性好,細胞能夠很好的貼附于支架上,細胞在NFM上生長良好； (2)PCL及gelatin所構建的NFM有較大的孔隙率,此結構有助于營養(yǎng)擴散及產物排出；其纖維結構與細胞外基質相似,可用作為細胞外基質,促進細胞生長； (3)ADSCs能在NFM上生長良好,在誘導情況下能表達成骨相關蛋白(OCN,OPN及OPG); (4)ADSCs載荷NFM構建的三維支架結構能促進ADSCs向成骨細胞分化并促進表達相應成骨基因表達,促進成骨發(fā)生。第3章ADSCs載荷的NFM層層組裝構建的3維支架修復大鼠顱骨缺損目的：本研究將ADSCs載荷的NFM層層組裝構建的3維支架應用于修復大鼠顱骨缺損,明確其在大鼠體內的成骨效果。方法： (1)按第二部分所述的方法,將ADSCs種植于NFM上進行層層組裝構建ADSCs載荷的NFM層層組裝3維支架； (2)將以上3維支架種植于大鼠顱骨缺損部位,術后12周取材,并對大體標本進行觀察； (3)應用micro-CT方法對以上所有樣本進行掃描,明確所有樣品再生骨組織的骨礦物質密度,對樣品進行三維重建明確骨修復的情況； (4)應用HE染色及Masson染色比較各組樣品骨修復情況的差異； (5)各組樣品進行RT-qPCR檢測,采用獨立樣本t檢驗的統(tǒng)計學方法進行對比,明確各組在各成骨相關基面表達上的差異。結果： (1)各組樣品大體結果示：ADSCs載荷的NFM層層組裝修復組的顱骨缺損樣品表面平整,已無缺損殘留,其對顱骨缺損的修復效果最好。(2) micro-CT檢查結果示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復組的再生骨組織的礦物質密度為823.047±47.010mg/cm3,較其他兩組再生骨組織的礦物質密度高(缺損組的BMD 58.348±4.435,NFM組的BMD為610.666±51.733,ADSC-NFM組的BMD為823.047±47.010,三者比較F=857.565,P0.001,差異較有顯著統(tǒng)計學意義)。三維重建結果示該組的原顱骨缺損區(qū)域已大部分修復,且修復組織無顯著臺階感。(3)HE染色及Masso n染色結果均示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復組生成的骨組織最多,結構與正常骨相似,其修復效果最好。 (4)各組樣品進行RT-qPCR檢測,各成骨相關基因表達示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復組的成骨基因表達均高于顱骨缺損組OCN(t=13.355,P=0.006)、OPN (t=22.535, P=0.002)、OPG(t=22.67, P=0.002);BSP (r=24.268,PBSP=0.002)、RUNX2(t=8.510,P=0.014)、OSX (t=12.722,P=0.006)及層層組裝的NFM修復組即NFM組的OCN(t-7.815,P=0.001)、OPN (t=-10.288,P=0.002)、OPG (t-5.528,P=0.05)、BSP (t=-22.721, P0.001)、RUNX2 (t=-7.053,P=0.001)及OSX (t=-9.441,P=0.001)。結論： (1)ADSCs可以在NFM層層組裝3D支架上分化促時成骨相關基因蛋白的表達,促進骨的形成； (2)ADSCs載荷的NFM層層組裝的三維支架材料可以用于骨組織工程中骨缺損的修復： (3)NFM層層組裝3D支架有助于ADSCs向成骨細胞分化。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.1
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本文編號：1152789