本文關(guān)鍵詞：BMP-7 siRNA對UVECs與BMSCs共培養(yǎng)體系植入后體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

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【摘要】：[目的]骨缺損的修復(fù)是一個受多種生長因子和激素調(diào)控的復(fù)雜過程,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein, BMP-7)是骨及骨軟骨形成過程的關(guān)鍵性生長因子,能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞,在骨和軟骨的形成中發(fā)揮著重要功能。研究發(fā)現(xiàn)UVECs和BMSCs共培養(yǎng)可以通過BMP促進(jìn)成骨分化的同時刺激成骨細(xì)胞及成骨前細(xì)胞釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),而VEGF在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的同時,也提高了UVECs對BMP的表達(dá),兩者相互作用,形成正反饋。本研究應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默大鼠UVECs中的BMP-7基因,并與BMSCs聯(lián)合培養(yǎng)復(fù)合部分脫蛋白生物骨移植修復(fù)大鼠骨缺損模型,通過增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)示蹤、免疫印跡檢測、免疫組織化學(xué)等方法檢測BMP-7、VEGF、SDF-1表達(dá)水平的相關(guān)性,繼而揭示BMP/VEGF/SDF-1信號通路在細(xì)胞歸巢中可能的作用機(jī)制。[方法](1)原代培養(yǎng)大鼠BMSCs,借助BMSCs貼壁生長的特性進(jìn)行純化,在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。將BMSCs傳代擴(kuò)增培養(yǎng)至第3代,流式細(xì)胞儀檢測CD34、CD2、CD45、CD90表面抗原表達(dá),對BMSCs表型進(jìn)行鑒定,并行成骨、成脂誘導(dǎo)實驗。(2)eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后,篩選出成功轉(zhuǎn)化的單克隆菌落,擴(kuò)大培養(yǎng),轉(zhuǎn)染BMSCs。(3)設(shè)計4條針對BMP-7基因的siRNA序列,將所設(shè)計好的siRNA序列擴(kuò)增后插入質(zhì)粒載體,運用慢病毒轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的4條干擾基因序列轉(zhuǎn)染到血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi),并采用熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效果、RT-PCR檢測BMP-7 mRNA的表達(dá)、WesternBlotting檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞BMP-7蛋白的表達(dá),篩選出其中最為高效的BMP-7 siRNA序列。(4)將大鼠UVECs培養(yǎng)擴(kuò)增后與第3代BMSCs按1：1比例復(fù)合部分脫蛋白骨建立起聯(lián)合細(xì)胞培養(yǎng)組；將經(jīng)BMP-7siRNA序列干擾處理的UVECs和第3代BMSCs按1：1比例建立起聯(lián)合細(xì)胞培養(yǎng)干擾組。(5)制作大鼠股骨缺損模型,復(fù)合部分脫蛋白骨的各組細(xì)胞植入骨缺損部位。(6) Western blotting 和 RT-PCR 行 VEGF, BMP-7, SDF-1檢測；免疫組化檢測eGFP穩(wěn)定表達(dá)的BMSCs歸巢情況；ELISA檢測VEGF 及 SDF-1表達(dá)水平。[結(jié)果](1)采用全骨髓貼壁法分離、純化大鼠原代BMSCs,經(jīng)流式鑒定符合骨髓來源干細(xì)胞表面標(biāo)記特性,純度較高,符合后續(xù)實驗要求。(2)原代培養(yǎng)的大鼠BMSCs,經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo),可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化。(3) eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以后篩選出成功轉(zhuǎn)化的單克隆菌落,擴(kuò)大培養(yǎng),轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,嘌呤霉素篩選后,熒光顯微鏡下看到明亮清晰的綠色熒光。(4)4條BMP-7干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染UVECs 72h后提取細(xì)胞樣品的總RNA, RT-PCR檢測篩選出一個干擾效果最強(qiáng)的質(zhì)粒用于包裝慢病毒,結(jié)果顯示BMP7-3 siRNA的干擾效果最強(qiáng)。(5)對4條質(zhì)粒干擾后的UVECs 行 Western Blotting檢測干擾后的BMP-7蛋白表達(dá)情況,BMP7-3 siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞BMP-7蛋白表達(dá)量明顯降低。(6)通過Western-blotting、RT-PCR、ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：實驗各組UVECs和BMSCs聯(lián)合培養(yǎng)體系植入后體內(nèi)的SDF-1、VEGF、BMP-7表達(dá)水平有顯著差異。(7)大鼠尾靜脈注射標(biāo)記eGFP的BMSCs后,免疫組化染色發(fā)現(xiàn)骨缺損部位的組織切片eGFP染色陽性,證明標(biāo)記了eGFP的BMSCs有歸巢的現(xiàn)象。[結(jié)論](1)采用全骨髓貼壁法分離、純化的大鼠原代BMSCs,經(jīng)流式鑒定符合骨髓來源干細(xì)胞表面標(biāo)記特性,純度較高,符合后續(xù)實驗要求。(2)eGFP慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSCs,熒光顯微鏡下可見大片穩(wěn)定、明亮的綠色熒光,用該技術(shù)也成功運用于將標(biāo)記有紅色熒光蛋白的BMP-7干擾序列轉(zhuǎn)染到大鼠UVECs中。(3)實驗中構(gòu)建的干擾質(zhì)粒BMP-7-3序列正確有效,干擾效率最高,能夠達(dá)到實驗中干擾臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)BMP-7的要求。(4)尾靜脈注射標(biāo)記了綠色熒光蛋白的BMSCs有向缺損部位歸巢的趨勢。(5)干擾了BMP-7基因前后的UVECs聯(lián)合培養(yǎng)體系植入大鼠體內(nèi),引起體內(nèi)SDF-1、VEGF、BMP-7活性因子的表達(dá)水平的差異。(6)干擾了BMP-7基因的UVECs聯(lián)合培養(yǎng)體系植入體內(nèi)對BMSCs的歸巢影響效果不同,BMP/VEGF/SDF-1信號通路可能在細(xì)胞歸巢機(jī)制中起了作用。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R687.3;R318.08

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1151932