本文關(guān)鍵詞：SF-1甲基化異常在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的初步研究

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【摘要】：子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率居高不下,且病死率呈上升趨勢。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展是內(nèi)外多種因素相互作用的結(jié)果,長期雌激素刺激是其主要危險(xiǎn)因素。研究表明,在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展中存在DNA甲基化異常,低甲基化是腫瘤發(fā)生過程中的早期的表觀遺傳學(xué)改變。SF-1基因是雌激素生物合成重要的轉(zhuǎn)錄因子,能夠激活膽固醇遷移和類固醇生成所涉及的基因表達(dá),在類固醇激素的生物合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。那么SF-1基因是否在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用并受到甲基化調(diào)控?這種作用又是通過何種分子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的?因此本研究首先在組織水平檢測子宮內(nèi)膜癌SF-1表達(dá)及其基因啟動子甲基化狀態(tài)；然后通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),探討SF-1基因甲基化異常對子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制,將從新的分子靶點(diǎn)探尋子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)標(biāo)志物,為子宮內(nèi)膜癌的有效診治策略提供可借鑒的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1基因啟動子甲基化狀態(tài)及其臨床意義目的檢測子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織和正常子宮內(nèi)膜組織中SF-1蛋白和甲基化相關(guān)蛋白DNMTs的表達(dá)以及SF-1基因啟動子的甲基化狀態(tài),探討子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法1.采用免疫組織化學(xué)方法,檢測正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1蛋白的表達(dá)情況。2.采用western blot方法,檢測正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1蛋白和DNMTs蛋白的表達(dá)水平。3.分析子宮內(nèi)膜癌組織中,SF-1蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。4.采用BSP方法,檢測子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果1.IHC顯示,子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1蛋白表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；且同一病例中子宮內(nèi)膜癌組織SF-1表達(dá)顯著高于子宮內(nèi)膜癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.WB結(jié)果顯示,在子宮內(nèi)膜癌組織中,SF-1蛋白呈高表達(dá),和癌旁組織比較,差異有顯著性(P0.05),和正常內(nèi)膜組織比較,差異有極顯著性(P0.01)。甲基化相關(guān)蛋白DNMT3a和DNMT3b在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)明顯低于子宮內(nèi)膜癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.在不同病理類型、不同病理分級的子宮內(nèi)膜癌中,SF-1蛋白的表達(dá)水平不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。腫瘤組織病理分級越高,其SF-1表達(dá)水平越高；特殊類型子宮內(nèi)膜癌中SF-1表達(dá)明顯高于子宮內(nèi)膜樣腺癌。4.BSP結(jié)果顯示,甲基化胞嘧啶百分比在子宮內(nèi)膜癌組織(8.2%)明顯低于癌旁組織(40.9%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明SF-1基因啟動子在子宮內(nèi)膜癌組織呈低甲基化狀態(tài)。結(jié)論1.SF-1在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起促進(jìn)作用,其異常高表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān)。2.SF-1基因啟動子區(qū)的異常低甲基化可能是其蛋白表達(dá)水平升高的原因,SF-1基因啟動子低甲基化狀態(tài)在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制中可能起著重要的作用。第二部分SF-1基因啟動子甲基化異常對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的影響目的利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-CdR)處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后,使SF-1去甲基化,研究SF-1基因啟動子甲基化異常對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞SF-1表達(dá)及生物學(xué)行為的影響。方法1.以子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-A, RL95-2為研究對象,分別加以不同濃度的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR,每種細(xì)胞系分成不同濃度的5-Aza-CdR組和未經(jīng)任何處理的對照組。2.采用EdU熒光標(biāo)記法測定不同濃度5-Aza-Cd R組處理后的細(xì)胞增殖情況。3. Western blot方法檢測不同濃度5-Aza-CdR組和對照組細(xì)胞中SF-1表達(dá)的差異。4.BSP法檢測5-Aza-CdR處理后細(xì)胞SF-1基因啟動子甲基化水平。5.采用qPCR法檢鋇5-Aza-CdR處理細(xì)胞后SF-1下游靶基因StAR, HSD3β2和CYP19A1 mRNA的表達(dá)。6.通過流式細(xì)胞儀檢測5-Aza-CdR組和對照組細(xì)胞凋亡的情況,以及采用Western blot方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和細(xì)胞周期蛋白Cyclin D3的表達(dá)。結(jié)果1.根據(jù)EdU檢測細(xì)胞增殖結(jié)果,低濃度5-Aza-CdR對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用,高濃度5-Aza-CdR對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,抑制細(xì)胞增殖(P0.05)。2. Western blot結(jié)果顯示,在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-A和RL95-2中,SF-1蛋白呈一定水平的表達(dá),經(jīng)過5-Aza-CdR處理后兩種細(xì)胞株均表現(xiàn)為SF-1表達(dá)升高,與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.BSP測序結(jié)果顯示,低濃度5-Aza-CdR明顯降低SF-1基因啟動子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平(P0.05)。4.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),5-Aza-CdR處理后SF-1下游靶基因StAR, HSD3β2和CYP19A1 mRNA的表達(dá)明顯增高(P0.05)5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示：與對照組相比,低濃度5-Aza-CdR組細(xì)胞凋亡明顯減少,高濃度5-Aza-CdR組細(xì)胞凋亡明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn),1.0uM 5-Aza-CdR處理后細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯增加,Bcl-2/Bax比值增加,或Caspase-3表達(dá)明顯降低(P0.05)；5.0uM 5-Aza-CdR處理后Bax表達(dá)極顯著升高(P0.01),或Bcl-2表達(dá)明顯降低,Bcl-2/Bax比值下降,Caspase-3表達(dá)明顯升高(P0.05)。7.細(xì)胞周期蛋白Cyclin D3的表達(dá)檢測顯示,1.0 uM和2.5 uM的5-Aza-CdR作用后,細(xì)胞HEC-1-A和RL95-24中Cyclin D3的表達(dá)均明顯增加(P0.05)。結(jié)論1.通過5-Aza-CdR抑制SF-1基因啟動子甲基化水平后,能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞SF-1表達(dá),說明子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞SF-1高表達(dá)與SF-1基因啟動子區(qū)去甲基化有關(guān)。2.SF-1去甲基化,表達(dá)上調(diào)后,其下游靶基因表達(dá)增加,子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),細(xì)胞凋亡受到抑制,說明SF-1基因在子宮內(nèi)膜癌中具有癌基因的特點(diǎn)。3.SF-1基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用,SF-1甲基化水平可能成為預(yù)測內(nèi)膜癌增殖能力的新的分子靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：子宮內(nèi)膜癌 類固醇生成因子-1 DNA甲基化 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 子宮內(nèi)膜癌 類固醇生成因子-1 DNA甲基化 腫瘤
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 符號說明5-8
• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 前言21-24
• 第一部分 子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1基因啟動子甲基化狀態(tài)及其臨床意義24-50
• 1 前言24-25
• 2 材料和方法25-36
• 3 結(jié)果36-42
• 4 討論42-48
• 5 小結(jié)48-50
• 第二部分 SF-1基因啟動子甲基化異常對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的影響50-77
• 1 前言50-51
• 2 材料和方法51-63
• 3 結(jié)果63-71
• 4 討論71-75
• 5 小結(jié)75-77
• 全文總結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 文獻(xiàn)綜述：類固醇生成因子-1與腺體腫瘤的關(guān)系85-94
• 參考文獻(xiàn)90-94
• 致謝94-95
• 博士期間發(fā)表的論文95

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 胡琢瑛;SF-1甲基化異常在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號：1128622