本文關(guān)鍵詞：microRNA-7調(diào)控胃癌惡性生物學(xué)行為的功能與分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 胃癌 mi R-7 增殖 轉(zhuǎn)移

【摘要】：【背景】胃癌是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均位居前列的惡性腫瘤。胃癌的發(fā)生是多種惡性生物學(xué)表型相互交織、相互影響、相互促進(jìn)的序貫過(guò)程,其本質(zhì)是細(xì)胞中分子事件從穩(wěn)態(tài)走向紊亂的總和。因此,研究胃癌發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵分子事件,闡明其中的分子調(diào)控機(jī)制,將為胃癌臨床治療提供新的思路和方法。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)在真核細(xì)胞中發(fā)揮重要調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼RNA。mi RNA通過(guò)與蛋白編碼基因m RNA結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá),從而調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生過(guò)程。mi RNA的調(diào)控特點(diǎn)在于其“一對(duì)多”的作用模式,即單個(gè)mi RNA可通過(guò)堿基不完全互補(bǔ)配對(duì)方式抑制多個(gè)基因表達(dá)。此種調(diào)控方式可引起細(xì)胞內(nèi)大量分子相互作用關(guān)系和信號(hào)傳導(dǎo)通路改變,因此,mi RNA被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)鍵分子之一。micro RNA-7(mi R-7)于2001年首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。2008年以來(lái),mi R-7在腫瘤中的作用被陸續(xù)報(bào)道,稱(chēng)其在肝癌、肺癌和乳腺癌中表達(dá)降低,發(fā)揮抑癌基因的作用;近年來(lái),亦有報(bào)道指出mi R-7可促進(jìn)腎癌的發(fā)生�？梢�(jiàn),mi R-7在腫瘤中的功能與機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)比對(duì)高、低轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞系的mi RNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)mi R-7在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中表達(dá)量顯著降低,提示其可能在胃癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用�；谖墨I(xiàn)報(bào)道和前期研究結(jié)果,本研究將進(jìn)一步聚焦mi R-7,為闡明其在胃癌惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮的關(guān)鍵功能和調(diào)控機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)�！灸康摹�1.明確mi R-7與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。2.明確mi R-7在調(diào)控胃癌惡性生物學(xué)行為中所發(fā)揮的功能。3.揭示mi R-7在胃癌中發(fā)揮功能的分子生物學(xué)機(jī)制。4.揭示mi R-7在胃癌中表達(dá)失調(diào)的原因。【方法】1.利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)胃上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞、胃癌新鮮組織標(biāo)本及其匹配的癌旁正常組織中mi R-7的表達(dá)差異;利用原位雜交(ISH)技術(shù)檢測(cè)胃癌組織芯片中mi R-7的表達(dá)水平,并統(tǒng)計(jì)分析其與胃癌病理參數(shù)間的相關(guān)性。2.合成mi R-7的模擬物和抑制物,并構(gòu)建mi R-7的過(guò)表達(dá)和sh RNA干擾載體,分別通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定感染,建立mi R-7的功能獲得與功能缺失細(xì)胞模型;分別通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、平板集落形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)、裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)和裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)等方法,研究上、下調(diào)mi R-7對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的影響。3.聯(lián)合運(yùn)用c DNA基因芯片技術(shù)和蛋白組學(xué)i TRAQ技術(shù),分別在胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組兩個(gè)層次,高通量篩選過(guò)表達(dá)mi R-7后的差異表達(dá)基因,并結(jié)合生物信息學(xué)方法,篩選差異表達(dá)基因中的mi R-7直接作用靶分子;采用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),驗(yàn)證mi R-7與候選靶分子間的相互作用關(guān)系;在胃癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)mi R-7后,利用蛋白印跡(Western blot)和實(shí)時(shí)定量PCR方法分別檢測(cè)候選靶分子的表達(dá)變化;通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)和功能挽救實(shí)驗(yàn),分別驗(yàn)證mi R-7的靶分子在胃癌惡性生物學(xué)行為中所發(fā)揮的功能以及mi R-7通過(guò)調(diào)控這一靶分子對(duì)胃癌惡性生物學(xué)行為的影響。4.通過(guò)生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)mi R-7啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);通過(guò)上調(diào)或下調(diào)這一轉(zhuǎn)錄因子,采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)mi R-7初始轉(zhuǎn)錄本(primary mi R-7,pri-mi R-7)的表達(dá)變化;利用染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)實(shí)驗(yàn),在胃癌細(xì)胞中驗(yàn)證此轉(zhuǎn)錄因子與mi R-7啟動(dòng)子的結(jié)合情況;在胃癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)mi R-7,分別利用免疫熒光和實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測(cè)mi R-7對(duì)此轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和定位,以及其下游效應(yīng)分子表達(dá)的影響。【結(jié)果】1.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,與正常胃上皮細(xì)胞相比,mi R-7在胃癌細(xì)胞中表達(dá)降低,且在高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)一步降低;與癌旁正常組織相比,mi R-7在胃癌組織中的表達(dá)降低,且在胃癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)較原發(fā)灶進(jìn)一步降低;組織芯片ISH結(jié)果表明,mi R-7在大多數(shù)胃癌臨床標(biāo)本中呈低表達(dá),其表達(dá)水平與胃癌分級(jí)和分期呈負(fù)相關(guān),與胃癌患者生存期呈正相關(guān),并可作為判斷胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。2.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,通過(guò)轉(zhuǎn)染和感染mi R-7的模擬物和抑制物,以及mi R-7的過(guò)表達(dá)載體和sh RNA干擾載體,能夠有效上、下調(diào)mi R-7在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、平板集落形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)表明,mi R-7能夠抑制胃癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)過(guò)程;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果表明mi R-7能夠抑制胃癌細(xì)胞周期進(jìn)展;通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果表明mi R-7能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞早期凋亡;Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mi R-7能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力;裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mi R-7能夠抑制胃癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程;裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mi R-7能夠抑制胃癌細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移灶的能力。3.在胃癌細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mi R-7后,聯(lián)合運(yùn)用c DNA基因芯片、i TRAQ技術(shù)和生物信息學(xué)方法,在全基因組的m RNA和蛋白水平高通量篩選出下調(diào)的差異表達(dá)基因分別為180個(gè)和75個(gè),其中重點(diǎn)關(guān)注mi R-7對(duì)RELA、FOS和IGF1R等與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移表型密切相關(guān)基因的調(diào)控;雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明,mi R-7能夠直接結(jié)合RELA、FOS和IGF1R的3’末端非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)上的結(jié)合位點(diǎn);實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果表明,mi R-7與RELA和FOS的m RNA和蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān),但其與IGF1R的負(fù)相關(guān)關(guān)系僅存在于蛋白水平;通過(guò)上調(diào)或下調(diào)RELA和FOS的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RELA和FOS能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖,抑制胃癌細(xì)胞凋亡;功能挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mi R-7能夠通過(guò)調(diào)控RELA和FOS抑制胃癌增殖;進(jìn)一步機(jī)制研究表明,mi R-7可通過(guò)負(fù)向調(diào)控IKKε抑制RELA的激活;通過(guò)上調(diào)或下調(diào)IGF1R的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IGF1R能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移;功能挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mi R-7能夠通過(guò)調(diào)控IGF1R抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移;進(jìn)一步機(jī)制研究表明,mi R-7可通過(guò)抑制IGF1R,降低Snail的表達(dá),間接促進(jìn)E-cadherin的表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程。4.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,在胃上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)IKKε和RELA可抑制pri-mi R-7的表達(dá),在胃癌細(xì)胞系中干擾IKKε和RELA可促進(jìn)pri-mi R-7的表達(dá);通過(guò)生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)到人類(lèi)基因組中mi R-7的3個(gè)編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域共存在7簇NF-κB的結(jié)合位點(diǎn);Ch IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RELA能夠與mi R-7-1和-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合;免疫熒光結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)mi R-7可抑制IKKε和RELA的表達(dá),并能夠抑制RELA的核轉(zhuǎn)位;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)mi R-7可抑制NF-κB信號(hào)通路下游多個(gè)效應(yīng)分子的表達(dá);啟動(dòng)子報(bào)告基因和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,幽門(mén)螺桿菌感染能夠上調(diào)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,并抑制pri-mi R-7的表達(dá)。【結(jié)論】本研究明確了mi R-7在胃癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)模式,揭示了mi R-7表達(dá)降低與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)性;明確了mi R-7在調(diào)控胃癌惡性生物學(xué)行為中所發(fā)揮的功能,表明其在胃癌中起到抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和抑制轉(zhuǎn)移的作用;揭示了mi R-7/IKKε/RELA和mi R-7/IGF1R/Snail兩條分子通路分別影響胃癌增殖和轉(zhuǎn)移表型的分子機(jī)制;揭示幽門(mén)螺桿菌感染導(dǎo)致NF-κB分子通路過(guò)度激活對(duì)mi R-7在胃癌中表達(dá)降低的重要影響。本研究為認(rèn)識(shí)mi R-7在胃癌惡性生物學(xué)表型中發(fā)揮的關(guān)鍵功能與調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),并使得mi R-7有望成為胃癌臨床治療行之有效且機(jī)制確鑿的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 mi R-7 增殖 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表7-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-18
• 前言18-19
• 文獻(xiàn)回顧19-31
• 第一部分 miR-7 在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中的表達(dá)模式及其臨床意義31-41
• 1 材料31-33
• 1.1 細(xì)胞系31
• 1.2 組織標(biāo)本31-32
• 1.3 主要試劑32
• 1.4 主要儀器32-33
• 2 方法33-36
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)33
• 2.2 細(xì)胞和組織總RNA的提取33
• 2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞和組織中miR-7 的表達(dá)33-34
• 2.4 組織原位雜交檢測(cè)組織芯片中miR-7 的表達(dá)34-36
• 3 結(jié)果36-39
• 3.1 miR-7 在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中的表達(dá)模式36-37
• 3.2 miR-7 表達(dá)與胃癌分級(jí)、分期的相關(guān)性37-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 miR-7 在胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的功能研究41-54
• 1 材料41-42
• 1.1 載體41
• 1.2 細(xì)胞系41
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物41
• 1.4 主要試劑41-42
• 1.5 主要儀器42
• 2 方法42-46
• 2.1 構(gòu)建miR-7 功能獲得和功能缺失細(xì)胞模型42-43
• 2.2 過(guò)表達(dá)或沉默miR-7 后的體外功能實(shí)驗(yàn)43-45
• 2.3 過(guò)表達(dá)或沉默miR-7 后的體外功能實(shí)驗(yàn)45-46
• 3 結(jié)果46-51
• 3.1 構(gòu)建miR-7 功能獲得和功能缺失細(xì)胞模型46-47
• 3.2 miR-7 抑制胃癌細(xì)胞體外增殖、促進(jìn)凋亡和逆轉(zhuǎn)耐藥47-49
• 3.3 miR-7 抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲49-50
• 3.4 miR-7 抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移50-51
• 4 討論51-54
• 第三部分 miR-7 靶分子的高通量篩選與鑒定54-67
• 1 材料54-55
• 1.1 細(xì)胞系54
• 1.2 載體54
• 1.3 基因芯片54
• 1.4 主要試劑54-55
• 1.5 主要儀器55
• 2 方法55-60
• 2.0 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染構(gòu)建miR-7 過(guò)表達(dá)模型55-56
• 2.1 iTRAQ技術(shù)高通量篩選miR-7 過(guò)表達(dá)后的差異表達(dá)蛋白56
• 2.2 cDNA基因芯片高通量篩選mi R-7 過(guò)表達(dá)后的差異表達(dá)基因56-57
• 2.4 iTRAQ與基因芯片高通量篩選結(jié)果的數(shù)據(jù)分析57
• 2.5 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-7 對(duì)靶分子的結(jié)合57-59
• 2.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中RELA、FOS和IGF1R的表達(dá)59
• 2.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中RELA、FOS和IGF1R的表達(dá)59-60
• 3 結(jié)果60-63
• 3.1 聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)方法篩選miR-7 的靶分子60-61
• 3.2 RELA、FOS和IGF1R是miR-7 的直接靶分子61-62
• 3.3 miR-7 負(fù)性調(diào)控RELA、FOS和IGF1R的表達(dá)62-63
• 4 討論63-67
• 第四部分miR-7 調(diào)控胃癌發(fā)生的機(jī)制研究67-86
• 1 材料67-68
• 1.1 載體67
• 1.2 細(xì)胞系67
• 1.3 組織芯片67
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物67
• 1.5 主要試劑67-68
• 1.6 主要儀器68
• 2 方法68-71
• 2.1 過(guò)表達(dá)或沉默RLEA和FOS對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響68-69
• 2.2 螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-7 對(duì)IKKε 的直接調(diào)控作用69
• 2.3 Ch IP驗(yàn)證RELA與miR-7 啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合69-70
• 2.4 miR-7 對(duì)胃癌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的影響70
• 2.5 幽門(mén)螺桿菌感染對(duì)miR-7 生成的影響70-71
• 2.6 IHC檢測(cè)胃癌組織芯片中RELA和FOS的表達(dá)71
• 3 結(jié)果71-81
• 3.1 miR-7 通過(guò)調(diào)控RELA和FOS抑制胃癌增殖71-74
• 3.2 miR-7 與NF-κB構(gòu)成雙負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路74-80
• 3.3 miR-7 與RELA及FOS在胃癌組織中表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)80-81
• 4 討論81-86
• 第五部分miR-7 調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究86-98
• 1 材料86-87
• 1.1 載體86
• 1.2 細(xì)胞系86
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物86
• 1.4 組織芯片86
• 1.5 主要試劑86-87
• 1.6 主要儀器87
• 2 方法87-88
• 2.1 過(guò)表達(dá)或沉默IGF1R對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響87-88
• 2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)E-cadherin上游轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達(dá)88
• 2.3 miR-7 對(duì)胃癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響88
• 2.4 IHC檢測(cè)胃癌組織芯片中IGF1R的表達(dá)88
• 3 結(jié)果88-95
• 3.1 miR-7 通過(guò)調(diào)控IGF1R抑制胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移88-92
• 3.2 miR-7 抑制胃癌細(xì)胞EMT92
• 3.3 miR-7 通過(guò)抑制IGF1R/Snail分子通路促進(jìn)E-cadherin表達(dá)92-93
• 3.4 miR-7 與IGF1R在胃癌組織中表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)93-95
• 4 討論95-98
• 小結(jié)98-99
• 參考文獻(xiàn)99-108
• 附錄108-121
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果121-123
• 致謝123

，

本文編號(hào)：1077903