本文關鍵詞：microRNA-7調(diào)控胃癌惡性生物學行為的功能與分子機制研究

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【摘要】：【背景】胃癌是我國乃至世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均位居前列的惡性腫瘤。胃癌的發(fā)生是多種惡性生物學表型相互交織、相互影響、相互促進的序貫過程,其本質(zhì)是細胞中分子事件從穩(wěn)態(tài)走向紊亂的總和。因此,研究胃癌發(fā)生過程中的關鍵分子事件,闡明其中的分子調(diào)控機制,將為胃癌臨床治療提供新的思路和方法。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一類在真核細胞中發(fā)揮重要調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼RNA。mi RNA通過與蛋白編碼基因m RNA結合,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達,從而調(diào)控機體的生長發(fā)育和疾病發(fā)生過程。mi RNA的調(diào)控特點在于其“一對多”的作用模式,即單個mi RNA可通過堿基不完全互補配對方式抑制多個基因表達。此種調(diào)控方式可引起細胞內(nèi)大量分子相互作用關系和信號傳導通路改變,因此,mi RNA被認為是調(diào)控細胞生物學行為的關鍵分子之一。micro RNA-7(mi R-7)于2001年首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。2008年以來,mi R-7在腫瘤中的作用被陸續(xù)報道,稱其在肝癌、肺癌和乳腺癌中表達降低,發(fā)揮抑癌基因的作用;近年來,亦有報道指出mi R-7可促進腎癌的發(fā)生�？梢�,mi R-7在腫瘤中的功能與機制仍不明確。本實驗室前期通過比對高、低轉(zhuǎn)移胃癌細胞系的mi RNA表達譜,發(fā)現(xiàn)mi R-7在高轉(zhuǎn)移細胞系中表達量顯著降低,提示其可能在胃癌發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用�；谖墨I報道和前期研究結果,本研究將進一步聚焦mi R-7,為闡明其在胃癌惡性生物學行為中發(fā)揮的關鍵功能和調(diào)控機制提供理論和實驗依據(jù)。【目的】1.明確mi R-7與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關性。2.明確mi R-7在調(diào)控胃癌惡性生物學行為中所發(fā)揮的功能。3.揭示mi R-7在胃癌中發(fā)揮功能的分子生物學機制。4.揭示mi R-7在胃癌中表達失調(diào)的原因�！痉椒ā�1.利用實時定量PCR方法檢測胃上皮細胞和胃癌細胞、胃癌新鮮組織標本及其匹配的癌旁正常組織中mi R-7的表達差異;利用原位雜交(ISH)技術檢測胃癌組織芯片中mi R-7的表達水平,并統(tǒng)計分析其與胃癌病理參數(shù)間的相關性。2.合成mi R-7的模擬物和抑制物,并構建mi R-7的過表達和sh RNA干擾載體,分別通過瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定感染,建立mi R-7的功能獲得與功能缺失細胞模型;分別通過細胞生長曲線、平板集落形成實驗、軟瓊脂集落形成實驗、流式細胞術、Transwell遷移和侵襲實驗、裸鼠移植瘤實驗和裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實驗等方法,研究上、下調(diào)mi R-7對胃癌細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為的影響。3.聯(lián)合運用c DNA基因芯片技術和蛋白組學i TRAQ技術,分別在胃癌細胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組兩個層次,高通量篩選過表達mi R-7后的差異表達基因,并結合生物信息學方法,篩選差異表達基因中的mi R-7直接作用靶分子;采用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng),驗證mi R-7與候選靶分子間的相互作用關系;在胃癌細胞中上調(diào)或下調(diào)mi R-7后,利用蛋白印跡(Western blot)和實時定量PCR方法分別檢測候選靶分子的表達變化;通過功能實驗和功能挽救實驗,分別驗證mi R-7的靶分子在胃癌惡性生物學行為中所發(fā)揮的功能以及mi R-7通過調(diào)控這一靶分子對胃癌惡性生物學行為的影響。4.通過生物信息學方法,預測mi R-7啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結合位點;通過上調(diào)或下調(diào)這一轉(zhuǎn)錄因子,采用實時定量PCR方法檢測mi R-7初始轉(zhuǎn)錄本(primary mi R-7,pri-mi R-7)的表達變化;利用染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)實驗,在胃癌細胞中驗證此轉(zhuǎn)錄因子與mi R-7啟動子的結合情況;在胃癌細胞中上調(diào)或下調(diào)mi R-7,分別利用免疫熒光和實時定量PCR方法,檢測mi R-7對此轉(zhuǎn)錄因子表達和定位,以及其下游效應分子表達的影響�！窘Y果】1.實時定量PCR結果表明,與正常胃上皮細胞相比,mi R-7在胃癌細胞中表達降低,且在高轉(zhuǎn)移胃癌細胞中表達進一步降低;與癌旁正常組織相比,mi R-7在胃癌組織中的表達降低,且在胃癌轉(zhuǎn)移灶中的表達較原發(fā)灶進一步降低;組織芯片ISH結果表明,mi R-7在大多數(shù)胃癌臨床標本中呈低表達,其表達水平與胃癌分級和分期呈負相關,與胃癌患者生存期呈正相關,并可作為判斷胃癌預后的獨立危險因素。2.實時定量PCR結果表明,通過轉(zhuǎn)染和感染mi R-7的模擬物和抑制物,以及mi R-7的過表達載體和sh RNA干擾載體,能夠有效上、下調(diào)mi R-7在胃癌細胞中的表達水平;細胞生長曲線、平板集落形成實驗和軟瓊脂集落形成實驗表明,mi R-7能夠抑制胃癌細胞的體外生長過程;通過流式細胞術檢測細胞周期,結果表明mi R-7能夠抑制胃癌細胞周期進展;通過流式細胞技術檢測細胞凋亡,結果表明mi R-7能夠促進胃癌細胞早期凋亡;Transwell遷移與侵襲實驗結果表明,mi R-7能夠抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力;裸鼠移植瘤實驗結果表明,mi R-7能夠抑制胃癌細胞的體內(nèi)生長過程;裸鼠轉(zhuǎn)移瘤實驗結果表明,mi R-7能夠抑制胃癌細胞形成轉(zhuǎn)移灶的能力。3.在胃癌細胞中瞬時轉(zhuǎn)染mi R-7后,聯(lián)合運用c DNA基因芯片、i TRAQ技術和生物信息學方法,在全基因組的m RNA和蛋白水平高通量篩選出下調(diào)的差異表達基因分別為180個和75個,其中重點關注mi R-7對RELA、FOS和IGF1R等與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移表型密切相關基因的調(diào)控;雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果表明,mi R-7能夠直接結合RELA、FOS和IGF1R的3’末端非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)上的結合位點;實時定量PCR和Western blot結果表明,mi R-7與RELA和FOS的m RNA和蛋白表達均呈負相關,但其與IGF1R的負相關關系僅存在于蛋白水平;通過上調(diào)或下調(diào)RELA和FOS的功能實驗結果表明,RELA和FOS能夠促進胃癌細胞增殖,抑制胃癌細胞凋亡;功能挽救實驗結果表明,mi R-7能夠通過調(diào)控RELA和FOS抑制胃癌增殖;進一步機制研究表明,mi R-7可通過負向調(diào)控IKKε抑制RELA的激活;通過上調(diào)或下調(diào)IGF1R的功能實驗結果表明,IGF1R能夠促進胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移;功能挽救實驗結果表明,mi R-7能夠通過調(diào)控IGF1R抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移;進一步機制研究表明,mi R-7可通過抑制IGF1R,降低Snail的表達,間接促進E-cadherin的表達,抑制胃癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程。4.實時定量PCR結果表明,在胃上皮細胞中過表達IKKε和RELA可抑制pri-mi R-7的表達,在胃癌細胞系中干擾IKKε和RELA可促進pri-mi R-7的表達;通過生物信息學方法,預測到人類基因組中mi R-7的3個編碼基因的啟動子區(qū)域共存在7簇NF-κB的結合位點;Ch IP實驗結果表明,RELA能夠與mi R-7-1和-2基因的啟動子區(qū)域相結合;免疫熒光結果表明,過表達mi R-7可抑制IKKε和RELA的表達,并能夠抑制RELA的核轉(zhuǎn)位;實時定量PCR結果表明,過表達mi R-7可抑制NF-κB信號通路下游多個效應分子的表達;啟動子報告基因和實時定量PCR結果表明,幽門螺桿菌感染能夠上調(diào)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,并抑制pri-mi R-7的表達�！窘Y論】本研究明確了mi R-7在胃癌細胞和組織中的表達模式,揭示了mi R-7表達降低與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關性;明確了mi R-7在調(diào)控胃癌惡性生物學行為中所發(fā)揮的功能,表明其在胃癌中起到抑制細胞增殖、促進凋亡和抑制轉(zhuǎn)移的作用;揭示了mi R-7/IKKε/RELA和mi R-7/IGF1R/Snail兩條分子通路分別影響胃癌增殖和轉(zhuǎn)移表型的分子機制;揭示幽門螺桿菌感染導致NF-κB分子通路過度激活對mi R-7在胃癌中表達降低的重要影響。本研究為認識mi R-7在胃癌惡性生物學表型中發(fā)揮的關鍵功能與調(diào)控機制提供了理論基礎,并使得mi R-7有望成為胃癌臨床治療行之有效且機制確鑿的新靶點。
【關鍵詞】：胃癌 mi R-7 增殖 轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語表7-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-18
• 前言18-19
• 文獻回顧19-31
• 第一部分 miR-7 在胃癌細胞和胃癌組織中的表達模式及其臨床意義31-41
• 1 材料31-33
• 1.1 細胞系31
• 1.2 組織標本31-32
• 1.3 主要試劑32
• 1.4 主要儀器32-33
• 2 方法33-36
• 2.1 細胞培養(yǎng)33
• 2.2 細胞和組織總RNA的提取33
• 2.3 實時定量PCR檢測細胞和組織中miR-7 的表達33-34
• 2.4 組織原位雜交檢測組織芯片中miR-7 的表達34-36
• 3 結果36-39
• 3.1 miR-7 在胃癌細胞和胃癌組織中的表達模式36-37
• 3.2 miR-7 表達與胃癌分級、分期的相關性37-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 miR-7 在胃癌細胞惡性生物學行為中的功能研究41-54
• 1 材料41-42
• 1.1 載體41
• 1.2 細胞系41
• 1.3 實驗動物41
• 1.4 主要試劑41-42
• 1.5 主要儀器42
• 2 方法42-46
• 2.1 構建miR-7 功能獲得和功能缺失細胞模型42-43
• 2.2 過表達或沉默miR-7 后的體外功能實驗43-45
• 2.3 過表達或沉默miR-7 后的體外功能實驗45-46
• 3 結果46-51
• 3.1 構建miR-7 功能獲得和功能缺失細胞模型46-47
• 3.2 miR-7 抑制胃癌細胞體外增殖、促進凋亡和逆轉(zhuǎn)耐藥47-49
• 3.3 miR-7 抑制胃癌細胞遷移和侵襲49-50
• 3.4 miR-7 抑制胃癌細胞體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移50-51
• 4 討論51-54
• 第三部分 miR-7 靶分子的高通量篩選與鑒定54-67
• 1 材料54-55
• 1.1 細胞系54
• 1.2 載體54
• 1.3 基因芯片54
• 1.4 主要試劑54-55
• 1.5 主要儀器55
• 2 方法55-60
• 2.0 瞬時轉(zhuǎn)染構建miR-7 過表達模型55-56
• 2.1 iTRAQ技術高通量篩選miR-7 過表達后的差異表達蛋白56
• 2.2 cDNA基因芯片高通量篩選mi R-7 過表達后的差異表達基因56-57
• 2.4 iTRAQ與基因芯片高通量篩選結果的數(shù)據(jù)分析57
• 2.5 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-7 對靶分子的結合57-59
• 2.6 實時定量PCR檢測細胞中RELA、FOS和IGF1R的表達59
• 2.7 Western blot檢測細胞中RELA、FOS和IGF1R的表達59-60
• 3 結果60-63
• 3.1 聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和生物信息學方法篩選miR-7 的靶分子60-61
• 3.2 RELA、FOS和IGF1R是miR-7 的直接靶分子61-62
• 3.3 miR-7 負性調(diào)控RELA、FOS和IGF1R的表達62-63
• 4 討論63-67
• 第四部分miR-7 調(diào)控胃癌發(fā)生的機制研究67-86
• 1 材料67-68
• 1.1 載體67
• 1.2 細胞系67
• 1.3 組織芯片67
• 1.4 實驗動物67
• 1.5 主要試劑67-68
• 1.6 主要儀器68
• 2 方法68-71
• 2.1 過表達或沉默RLEA和FOS對胃癌細胞增殖能力的影響68-69
• 2.2 螢光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-7 對IKKε 的直接調(diào)控作用69
• 2.3 Ch IP驗證RELA與miR-7 啟動子區(qū)域的結合69-70
• 2.4 miR-7 對胃癌細胞中NF-κB信號通路的影響70
• 2.5 幽門螺桿菌感染對miR-7 生成的影響70-71
• 2.6 IHC檢測胃癌組織芯片中RELA和FOS的表達71
• 3 結果71-81
• 3.1 miR-7 通過調(diào)控RELA和FOS抑制胃癌增殖71-74
• 3.2 miR-7 與NF-κB構成雙負反饋調(diào)控環(huán)路74-80
• 3.3 miR-7 與RELA及FOS在胃癌組織中表達水平呈負相關80-81
• 4 討論81-86
• 第五部分miR-7 調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移的機制研究86-98
• 1 材料86-87
• 1.1 載體86
• 1.2 細胞系86
• 1.3 實驗動物86
• 1.4 組織芯片86
• 1.5 主要試劑86-87
• 1.6 主要儀器87
• 2 方法87-88
• 2.1 過表達或沉默IGF1R對胃癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響87-88
• 2.2 實時定量PCR檢測E-cadherin上游轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達88
• 2.3 miR-7 對胃癌細胞EMT相關標志物表達的影響88
• 2.4 IHC檢測胃癌組織芯片中IGF1R的表達88
• 3 結果88-95
• 3.1 miR-7 通過調(diào)控IGF1R抑制胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移88-92
• 3.2 miR-7 抑制胃癌細胞EMT92
• 3.3 miR-7 通過抑制IGF1R/Snail分子通路促進E-cadherin表達92-93
• 3.4 miR-7 與IGF1R在胃癌組織中表達水平呈負相關93-95
• 4 討論95-98
• 小結98-99
• 參考文獻99-108
• 附錄108-121
• 個人簡歷和研究成果121-123
• 致謝123

，

本文編號：1077903