本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa在骨髓炎的作用研究

  更多相關(guān)文章： 骨髓炎 金黃色葡萄球菌 葡萄球菌A蛋白 殺白細胞素 凝固酶

【摘要】：研究背景和目的:骨髓炎是骨科的常見病和多發(fā)病,是骨組織受到細菌引起的骨髓腔、骨和骨膜及周圍組織的急性或慢性炎癥過程。金黃色葡萄球菌是骨髓炎主要的致病菌,占所有骨髓炎病例的80%。金黃色葡萄球菌的致病性是一個復(fù)雜的過程,其致病性的強弱取決于所產(chǎn)生的毒素和酶。殺白細胞素(PVL)是金黃色葡萄球菌分泌的一種特有的外毒素,屬于雙組份毒素家族的成員,由LukS-PV和LukF-PV組成。PVL通過在細胞膜上形成穿膜孔殺傷白細胞。很多研究顯示PVL在金黃色葡萄球菌所致的壞死性皮膚損害和壞死性肺炎等疾病起重要作用。葡萄球菌A蛋白(SpA)是葡萄球菌細胞壁的一種表面蛋白,可與多種哺乳動物IgG的Fc結(jié)合,具有抗吞噬,促細胞分裂,引起超敏反應(yīng)、損傷血小板等多種生物學(xué)活性。凝固酶(Coa)是金黃色葡萄球菌的重要致病因子,具有保護病原菌不被宿主細胞吞噬和避免抗體結(jié)合的作用。雖然PVL,SpA和Coa已經(jīng)被證實是金黃色葡萄球菌的重要致病因子,但是三者在金黃色葡萄球菌引起骨感染導(dǎo)致骨髓炎的作用仍不清楚。因此,本課題通過構(gòu)建金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa的過表達質(zhì)粒和基因刪除質(zhì)粒,運用各種檢測手段和方法觀察這三者對成骨細胞增殖和凋亡,骨代謝和分化以及核因子-κB受體活化因子配體(RANK-L)的影響,探討金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa在骨髓炎中的作用及可能的調(diào)控機制。研究方法:1)采用RT-PCR技術(shù)和酶切-連接克隆方法構(gòu)建PVL、SpA和Coa表達質(zhì)粒,利用同源重組構(gòu)建PVL、SpA和Coa基因刪除質(zhì)粒,并利用電轉(zhuǎn)將基因刪除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌,通過溫度和紅霉素抗性壓力篩選金黃色葡萄球菌PVL,SpA和Coa基因缺失突變株;2)運用MTT法和Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)觀察PVL,SpA和Coa對成骨細胞增殖和凋亡的影響,并利用western blot觀察金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa對成骨細胞中caspase-3和caspase-9活性的影響;3)利用分別轉(zhuǎn)染PVL,SpA和Coa表達質(zhì)�；蚧騽h除質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染MC3T3-E1細胞,運用RT-PCR方法觀察PVL,SpA和Coa對I型膠原(collagen I)、骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OC)mRNA表達水平的影響;4)轉(zhuǎn)染PVL、SpA和Coa表達質(zhì)�；蚧騽h除質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染mc3t3-e1細胞后,利用茜素紅法和vonkossa法觀察骨細胞的礦化結(jié)節(jié)情況,并利用堿性磷酸酶(alp)活性檢測試劑盒觀察alp的活性;5)利用分別轉(zhuǎn)染pvl、spa和coa表達質(zhì)�；蚧騽h除質(zhì)粒不同質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染mc3t3-e1細胞,運用elisa方法觀察pvl,spa和coa對細胞中rank-l表達的影響。研究結(jié)果:1)采用dna重組技術(shù)和同源重組,成功構(gòu)建金黃色葡萄球菌毒力因子pvl、spa和coa表達質(zhì)粒pmd19-t-pvl、pmd19-t-spa和pmd19-t-coa以及基因刪除質(zhì)粒pmad△pvl、pmad△spa和pmad△coa,并成功獲得金黃色葡萄球菌pvl,spa和coa基因缺失突變株pvl(-),spa(-)和coa(-);2)感染24h后,經(jīng)轉(zhuǎn)染了pvl,spa和coa表達質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染的mc3t3-e1細胞增殖抑制率分別為29.2%,42.8%和32.7%,與單純金黃色葡萄球菌感染組別(28.2%)相比均有升高;經(jīng)轉(zhuǎn)染了pvl,spa和coa基因刪除質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染的細胞增殖抑制率分別為12.3%,12.1%和17.2%,與單純金黃色葡萄球菌感染組別相比均有下降。隨著作用時間越長,轉(zhuǎn)染毒力因子表達質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染組別其抑制效果顯著地升高,而轉(zhuǎn)染毒力因子基因刪除質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌感染組別其抑制效果顯著地減弱;與單純金黃色葡萄球菌感染組相比,含有pvl,spa和coa表達質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組的mc3t3-e1細胞凋亡率明顯提高;而含有pvl,spa和coa基因刪除質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組的mc3t3-e1細胞凋亡率略有下降;pvl,spa和coa表達質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組細胞的pro-caspase-3表達量比單純金黃色葡萄球菌感染組明顯下降(p0.05),cleaved-caspase-3表達量顯著升高;而轉(zhuǎn)染pvl,spa和coa基因刪除質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組細胞的pro-caspase-3表達量比單純金黃色葡萄球菌感染組略有升高(p0.05),cleaved-caspase-3表達量略有下降,但是兩者之間無統(tǒng)計學(xué)意義。pro-caspase-9和cleaved-caspase-9的表達水平與pro-caspase-3和cleaved-caspase-9表達水平趨勢一致;3)金黃色葡萄球菌毒力因子pvl,spa和coa抑制collageni、opn和ocnmrna水平的表達;4)與未感染組相比,含有pvl,spa和coa表達質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組細胞的鈣沉淀顯著地降低(p0.05),alp活性也顯著地降低(p0.05)。與金黃色葡萄球菌感染組相比,含有pvl,spa和coa表達質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組細胞的鈣沉淀顯著地降低,alp活性也明顯地降低(p0.05);5)未感染組細胞中rank-l的表達非常低。與未感染組相比,金黃色葡萄球菌感染組,含有pvl,spa和coa表達質(zhì)�；蚧騽h除質(zhì)粒金黃色葡萄球菌感染組mc3t3-e1細胞的rank-l表達顯著地升高,具有統(tǒng)計意義(P0.05)。與培養(yǎng)基感染組相比,金黃色葡萄球菌感染組細胞的RANK-L表達明顯地增加(P0.05)。研究結(jié)論:1)金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa以時間依賴方式抑制MC3T3-E1細胞增殖,同時促進MC3T3-E1細胞發(fā)生凋亡,PVL,SpA和Coa可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)MC3T3-E1細胞發(fā)生凋亡;2)金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa抑制collagen I、OPN和OCN mRNA水平的表達,影響了成骨細胞的正常代謝;3)金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa抑制成骨細胞的礦化和ALP的活性,影響成骨細胞的分化;4)金黃色葡萄球菌毒力因子PVL,SpA和Coa促進成骨細胞中RANK-L的表達。由此推測PVL,SpA和Coa可能通過影響成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收過程,打破骨代謝的平衡,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,加重骨髓炎的程度。
【關(guān)鍵詞】：骨髓炎 金黃色葡萄球菌 葡萄球菌A蛋白 殺白細胞素 凝固酶
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R681.2
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 前言13-18
• 實驗一PVL，SPA和COA表達質(zhì) 粒和基因刪除質(zhì)粒的構(gòu)建18-44
• 一 材料與方法19-36
• 二 結(jié)果36-41
• 三 討論41-43
• 四 小結(jié)43-44
• 實驗二PVL，SPA和COA對 小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖和凋亡的影響44-64
• 一 材料與方法46-53
• 二 結(jié)果53-62
• 三 討論62-63
• 四 小結(jié)63-64
• 實驗三 金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SPA和COA對骨代 謝的影響64-76
• 一 材料與方法65-71
• 二 結(jié)果71-74
• 三 討論74-75
• 四 小結(jié)75-76
• 實驗四 金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SPA和COA對成骨細胞分化的影響76-87
• 一 材料與方法77-81
• 二 結(jié)果81-84
• 三 討論84-85
• 四 小結(jié)85-87
• 實驗五 金黃色葡萄球菌毒力因子PVL，SPA和COA對RANK-L表達的影響87-95
• 一 材料與方法88-92
• 二 結(jié)果92-93
• 三 討論93-94
• 四 小結(jié)94-95
• 全文總結(jié)95-97
• 參考文獻97-104
• 文獻綜述 金黃色葡萄球菌毒力因子的研究進展104-116
• 參考文獻111-116
• 在學(xué)期間發(fā)表的文章116-117
• 致謝117

【參考文獻】

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本文編號：1064573