本文關(guān)鍵詞：BMP-2、TGF-β3病毒載體與緩釋載體誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的對比研究

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【摘要】：第一部分滇南小耳豬BMSCs體外培養(yǎng)與鑒定[目的]探討滇南小耳豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)體外高效擴(kuò)增的方法,并對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。[方法]采用離心加貼壁法培養(yǎng)抽取的滇南小耳豬骨髓。流式細(xì)胞儀檢測P0、P1、P2代BMSCs CD29、CD44、CD45的表達(dá)；取P2代細(xì)胞行成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)分化,分別用油紅O、茜素紅、阿利新藍(lán)染色檢測BMSCs多向分化的能力。[結(jié)果](1)原代細(xì)胞形態(tài)為梭形,克隆樣生長,細(xì)胞長滿時(shí)呈漩渦樣；傳代后細(xì)胞形態(tài)變大,早期呈現(xiàn)三角形及多邊形。三角形細(xì)胞增殖較快,細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶時(shí)形態(tài)類似于原代細(xì)胞。隨著傳代次數(shù)的增加,多邊形細(xì)胞逐漸增多,細(xì)胞形態(tài)呈寬大扁平狀,折光性降低,細(xì)胞增殖緩慢。(2)流式細(xì)胞檢測P0、P1、P2代CD29陽性率分別為：73.10%、99.44%、99.49%；CD44陽性率分別為：69.74%、99.96%、99.52%；P1、P2代與P0代比較,組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；CD45陰性率為：99.68%、95.81%、99.93%,組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)10天,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴,油紅O染色陽性；成骨誘導(dǎo)14d后,細(xì)胞外基質(zhì)中有鈣結(jié)節(jié)形成,茜蘇紅染色陽性；成軟骨誘導(dǎo)21d后,細(xì)胞基質(zhì)呈藍(lán)色,阿利新藍(lán)染色陽性；[結(jié)論](1)離心加貼壁法可以成功培養(yǎng)并高效擴(kuò)增滇南小耳豬BMSCs。(2)擴(kuò)增至P2代以后的BMSCs具有較高純度,且保持多向分化潛能,可作為組織工程的種子細(xì)胞。第二部分Ad-BMP-2-EGFP、Ad-TGF-β3載體的構(gòu)建及其體外誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[目的]分別構(gòu)建含BMP-2、TGF-β3基因的重組腺病毒載體,雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染滇南小耳豬BMSCs并檢測其表達(dá),并對其體外誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化能力進(jìn)行檢測。[方法]用PCR方法擴(kuò)增人BMP-2和TGF-β3目的基因,將2個(gè)基因分別亞克隆至穿梭載體pEC3.1(+)中(其中與BMP-2連接的穿梭載體pEC3.1經(jīng)改構(gòu),帶有EGFP標(biāo)簽),構(gòu)建pEC-GIE3.1-BMP-2-EGFP和pEC-GIE3.1-TGF-β3重組質(zhì)粒,通過體外同源重組反應(yīng)將pEC-GIE3.1-BMP-2-EGFP、pEC-GIE3.1-TGF-β3重組至腺病毒骨架質(zhì)粒pGSadeno中,構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒pGSadeno-BMP-2、pGSadeno-TGF-β3,線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝,獲得重組腺病毒Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3。體外擴(kuò)增培養(yǎng)滇南小耳豬BMSCs,分別用Ad-BMP-2(A組,MOI=20)、Ad-TGF-β3(B組,MOI=50)和Ad-BMP-2+Ad-TGF-β3(C組,MOI=20、50)轉(zhuǎn)染,以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照(D組)。免疫熒光、Western-blot, ELISA、PCR檢測目的基因的表達(dá),Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR觀察其誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化情況。[結(jié)果]Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3經(jīng)PCR及測序鑒定,帶有BMP-2、TGF-β3基因的腺病毒載體在HEK293細(xì)胞中包裝成功,Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3病毒滴度分別為5.6×108、1.6×108pfu/mL。Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3雙基因共轉(zhuǎn)染滇南小耳豬BMSCs72h后,免疫熒光顯示：A組、B組胞漿內(nèi)有分別有紅色、綠色熒光表達(dá),C組同時(shí)表達(dá)紅色及綠色熒光,D組未見紅、綠熒光表達(dá)。PCR顯示：A組在310bp處可見條帶,B組在114bp處可見條帶,C組在310、114bp處同時(shí)可見條帶,D組未見目的條帶表達(dá)：ELISA檢測顯示：A、B、C組上清液中檢測到目的基因表達(dá),D組未見相關(guān)基因表達(dá)。Western-blot顯示：A組在18kd處有陽性條帶,B組在50 kd處有陽性條帶,C組在18、50 kd處可見條帶,D組未見目的條帶表達(dá)。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色示A、B、C組呈陽性,C組染色強(qiáng)于A、B組,D組染色呈陰性；RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染后1W,2W,3W同時(shí)間點(diǎn)比較,C組COL-2A、ACAN、SOX9相對表達(dá)量均高于A、B組。[結(jié)論](1)成功構(gòu)建了分別帶有BMP-2和TGF-β3基因的重組腺病毒載體,Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3轉(zhuǎn)染滇南小耳豬BMSCs后目的基因可成功表達(dá)。(2)與單基因轉(zhuǎn)染相比,Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染滇南小耳豬BMSCs可促進(jìn)BMSCs更加有效地分化為軟骨細(xì)胞。穿梭載體pEC3.1(+)中(其中與BMP-2連接的穿梭載體pEC3.1經(jīng)改構(gòu),帶有EGFP標(biāo)簽),構(gòu)建pEC-GIE3.1-BMP-2-EGFP和pEC-GIE3.1-TGF-β3重組質(zhì)粒,通過體外同源重組反應(yīng)將pEC-GIE3.1-BMP-2-EGFP、pEC-GIE3.1-TGF-β3重組至腺病毒骨架質(zhì)粒pGSadeno中,構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒pGSadeno-BMP-2、pGSadeno-TGF-β3,線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝,獲得重組腺病毒Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3。體外擴(kuò)增培養(yǎng)滇南小耳豬BMSCs,分別用Ad-BMP-2(A組,MOI=20)、Ad-TGF-β3(B組,MOI=50)和Ad-BMP-2+Ad-TGF-β3(C組,MOI=20、50)轉(zhuǎn)染,以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照(D組)。免疫熒光、Western-blot, ELISA、PCR檢測目的基因的表達(dá),Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR觀察其誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化情況。第三部分BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM復(fù)合支架的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究[目的]制備BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM復(fù)合支架,并研究其相關(guān)生物學(xué)特性。[方法](1)采用乳化交聯(lián)法制備BMP-2.TGF-β3殼聚糖緩釋微球,掃描電鏡觀察其形貌及粒徑,ELISA雙抗體夾心法測定載藥量、包封率及體外藥物緩釋率。(2)體外擴(kuò)增培養(yǎng)滇南小耳豬BMSCs,分別與BMP-2殼聚糖緩釋微球(A組)、TGF-β3殼聚糖緩釋微球(B組)和BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球(C組)共培養(yǎng),以殼聚糖空白微球作為對照(D組)。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色、ELISA、RT-PCR觀察各組誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化情況。(3)根據(jù)Urist描述的方法制備DBM,掃描電鏡觀察DBM的超微結(jié)構(gòu)及其孔隙率。(4)使用0.02%EDC作為交聯(lián)劑,將DBM與BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球復(fù)合,制備BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM復(fù)合支架。對復(fù)合支架作電鏡掃描觀察,以及紅外光譜檢測,與干細(xì)胞共培養(yǎng),評價(jià)其生物相容性。[結(jié)果](1)殼聚糖緩釋微球平均粒徑53.38μm,呈球形,BMP-2、TGF-β3包封率分別為65%、76%,載藥量為19.5ng/mg,11.4ng/mg;藥物釋放試驗(yàn)表明BMP-2和TGF-β3可以從微球中緩慢釋放,第7天累積釋放量達(dá)69%、62%；(2)ELISA檢測顯示：A、B、C組上清液中檢測到相關(guān)因子表達(dá),D組未見表達(dá)。同一時(shí)間點(diǎn)比較,緩釋載體相應(yīng)因子含量低于病毒載體組；Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色示C組染色強(qiáng)于A、B組,D組染色呈陰性；RT-PCR顯示1W,2W,3W同時(shí)間點(diǎn)比較,C組CCL-2A、ACAN相對表達(dá)量均高于A、B組；同一時(shí)間點(diǎn)比較,緩釋載體相應(yīng)因子含量低于病毒載體組；(3)DBM支架材料外觀呈白色海綿狀,SEM觀察DBM具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),平均孔隙直徑為119.42±6.46μm。(4) BMP-2. TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM復(fù)合支架材料外觀呈黃白色,SEM顯示：微球均勻地分布于DBM內(nèi),紅外線光譜檢測提示：微球與DBM形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合。[結(jié)論]BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM復(fù)合支架,在不改變DBM基本性能基礎(chǔ)上,賦予支架載藥緩釋能力,提高外源性生物因子的生物利用度,為組織工程提供了改良的支架。第四部分?jǐn)y載BMP-2、TGF-β3雙基因的腺病毒載體與雙因子緩釋載體復(fù)合BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨修復(fù)豬關(guān)節(jié)軟骨缺損的對比研究[目的]比較攜載BMP-2、TGF-β3雙基因腺病毒載體、殼聚糖緩釋載體復(fù)合BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨修復(fù)豬關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。[方法] 體外分別構(gòu)建攜載BMP-2、TGF-β3雙基因的BMSCs/DBM組織工程軟骨、BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM/BMSCs組織工程軟骨；成年滇南小耳豬9頭,18膝,共建立36個(gè)軟骨缺損模型；實(shí)驗(yàn)分組：Ⅰ組：右膝股骨外髁負(fù)重面缺損處植入BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM/BMSCs;Ⅱ組：右膝股骨內(nèi)髁負(fù)重面缺損處植入BMP-2、TGF-β3雙基因轉(zhuǎn)染的BMSCs/DBM;Ⅲ組：左膝股骨內(nèi)髁負(fù)重面缺損處植入DBM+BMSCs; Ⅳ組：左膝股骨外髁負(fù)重面缺損處單純植入DBM；于術(shù)后4、8、12周取材進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)觀察和組織學(xué)O'driscoll評分。[結(jié)果]軟骨缺損修復(fù)術(shù)后12周,Ⅱ組缺損區(qū)被光滑、乳白色類軟骨組織填充,HE染色顯示缺損區(qū)修復(fù)組織有典型的透明軟骨結(jié)構(gòu),與正常軟骨界限不清,優(yōu)于Ⅰ、Ⅲ 、Ⅳ組。O'driscoll評分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別為：11.03±1.08、13.65±1.33、9.13±0.55、7.38±1.35,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。[結(jié)論]攜載BMP-2、TGF-β3雙基因的BMSCs聯(lián)合DBM構(gòu)建的組織工程軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果優(yōu)于BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM復(fù)合支架。
【關(guān)鍵詞】：滇南小耳豬 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 分化 細(xì)胞培養(yǎng) 腺病毒 基因轉(zhuǎn)染 BMSCs BMP-2 TGF-β3 脫鈣骨基質(zhì) 殼聚糖 緩釋微球 BMP-2 TGF-β3 殼聚糖 緩釋微球 基因轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R681.3
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-21
• 參考文獻(xiàn)18-21
• 第一部分 滇南小耳豬BMSCs體外培養(yǎng)與鑒定21-37
• 1 引言21
• 2 材料和方法21-26
• 3 結(jié)果26-32
• 4 討論32-35
• 5 結(jié)論35
• 6 參考文獻(xiàn)35-37
• 第二部分 Ad5-BMP2-EGFP、Ad5-TGFβ3載體的構(gòu)建及其體外誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究37-76
• 1 引言37
• 2 材料和方法37-50
• 3 結(jié)果50-68
• 4 討論68-72
• 5 結(jié)論72
• 6 參考文獻(xiàn)72-76
• 第三部分 BMP-2、TGF-β3殼聚糖緩釋微球/DBM復(fù)合支架的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究76-100
• 1 引言76
• 2 材料和方法76-81
• 3 結(jié)果81-94
• 4 討論94-97
• 5 結(jié)論97
• 6 參考文獻(xiàn)97-100
• 第四部分 攜載BMP-2、TGF-β3雙基因的腺病毒載體與雙因子緩釋載體復(fù)合BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨修復(fù)豬關(guān)節(jié)軟骨缺損的對比研究100-121
• 1 引言100
• 2 材料和方法100-107
• 3 結(jié)果107-116
• 4 討論116-119
• 5 結(jié)論119
• 6 參考文獻(xiàn)119-121
• 全文總結(jié)121-123
• 綜述一、123-132
• 參考文獻(xiàn)128-132
• 綜述二、132-139
• 參考文獻(xiàn)135-139
• 攻讀期間發(fā)表和待發(fā)表的文章139-140
• 致謝140

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 陳立強(qiáng);李寧毅;袁榮濤;孫健;金曉明;劉斌鈺;;犬脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2007年03期

2 王鑫;李彥林;金耀峰;陳建明;王慧建;何川;曹樹海;趙灃凱;;Ad-BMP-2、Ad-TGF-β3轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合DBM構(gòu)建軟骨修復(fù)豬關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2014年18期

3 陳建明;李彥林;金耀峰;王偉;曹斌;李曉林;陳曉紅;劉向東;;兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在不同脫鈣程度骨基質(zhì)材料上的增殖[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年51期

4 金耀峰;李彥林;陳建明;王偉;李曉林;曹斌;陳曉紅;劉向東;;同種異體脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年51期

5 向強(qiáng);鄧聰穎;張遠(yuǎn);張超;周躍;;成骨細(xì)胞特異性鈣黏蛋白涂布脫鈣骨基質(zhì)材料對BMSCs黏附及成骨分化能力的影響[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2009年05期

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7 王鑫;李彥林;金耀峰;陳建明;王慧建;何川;曹樹海;趙灃凱;;BMP-2、TGF-β_3重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在滇南小耳豬BMSCs中的表達(dá)[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2014年07期

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本文編號：1063284