本文關鍵詞：腹瀉兒童及靈長類動物腸道病毒宏基因組學研究

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【摘要】：腹瀉是全球重要的公共衛(wèi)生問題,是感染性疾病中引發(fā)死亡的第三位病因。急性腹瀉在兒童群體內屬于常見病和多發(fā)病之一,在發(fā)展中國家急性腹瀉是導致嬰幼兒死亡的主要主要病因之一,其致病因素主要為寄生蟲、細菌和病毒感染。隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)和有效使用,加上水源供應和公共衛(wèi)生條件的改善,寄生蟲和細菌感染所導致的腹瀉類疾病得到了有效控制,而病毒性腹瀉大多沒有有效控制和治療方法,引起人們越來越多的關注。人類及動物消化道中存在龐大的病毒群落,這些病毒絕大多數(shù)是未知的。目前,人類對于新型病毒性腹瀉仍然沒有特殊的有效防治措施。因此,人類想要真正克服新型病毒導致的傳染性疾病,只有通過有效的方法提前發(fā)現(xiàn)潛在的致病性新型病毒,在此礎上對新型病毒進行基因組結構、流行病學、疫苗研究和治療性抗體開發(fā)等方面進行深入研究,從而為病毒性腹瀉防控、臨床診療等提供理論基礎和技術支持。病毒宏基因組學(Viral Metagenomics)是一種新型的病毒分子生物學檢測技術,該技術的創(chuàng)立和發(fā)展是基于宏基因組學(metagenomics)理論,結合現(xiàn)有的分子病毒學檢測方法開創(chuàng)的一個新的宏基因組學分支。該研究技術突破了傳統(tǒng)方法的局限,直接以臨床樣本中的所有病毒核酸為研究對象,有效地避開了病毒細胞培養(yǎng)、血清病毒抗原／抗體檢測和基于病毒已知序列的PCR擴增；病毒宏基因組學方法不僅能夠開速檢測出樣品中存在的已知病毒,更為重要的是該方法還能夠有效的檢測出新型及未知病毒；從而可以在獲得病毒基因序列的基礎上解析臨床標本中的病毒群落的組成甚至是病毒滴度,實時監(jiān)控特定病毒動態(tài)變化及分布,揭示新型或未知致病性病毒與特定疾病之間的關聯(lián)性,對于臨床診治新型或未知病毒所致疾病具有重要的理論和現(xiàn)實意義。靈長類動物與人類不僅體質特征很相似,而且社會行為也很相近,靈長類動物體內可能攜帶諸多人畜共患病病原體。因此,本研究采用病毒宏基因組學方法分析比較腹瀉兒童及靈長類動物群體糞便中病毒群落的差異并挖掘潛在的新型腹瀉相關病毒,研究結果對于病毒性腹瀉的診斷、治療及疾病暴發(fā)的防控具有重要的實際意義。本研究主要內容和結果如下：(一)腹瀉兒童腸道病毒群落的組成構建兒童腹瀉及健康對照組腸道病毒組基因文庫,通過Miseq高通量測序結合生物信息學調取文庫中所有可能的病毒基因,分析病毒群落的組成。結果顯示兒童腸道病毒群落的組成包括：杯狀病毒科(Caliciviridae),腺病毒科(Adenoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),呼腸孤病毒科(Reoviridae),噬菌體,細小病毒科(Parvoviridae),指環(huán)病毒科(Anelloviridae)及未分科病毒和少量的其他病毒。病毒群落分析提示：(1)盡管健康對照組兒童糞便樣品中病毒多樣性與腹瀉組無明顯差別,但病毒滴度顯著低于腹瀉組樣品。(2)腹瀉組和健康對照組所有文庫均為杯狀病毒陽性,但腹瀉組病毒滴度顯著高于健康對照組。 (3)星狀病毒不是本研究腹瀉群體的主要病因。(二)腹瀉靈長類動物腸道病毒群落的組成構建靈長類動物腹瀉及健康對照組腸道病毒組基因文庫,通過Miseq高通量測序結合生物信息學調取文庫中所有可能的病毒基因,分析病毒群落的組成。結果顯示靈長類動物腸道病毒群落的組成包括細小病毒科(Parvoviridae),帚狀病毒科(Virgaviridae),腺病毒科(Adenoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),噬菌體,雙生病毒科(Geminiviridae)病毒,圓環(huán)病毒科(Circoviridae),修道院病毒科(Closteroviridae),二順反子病毒科(Dicistroviridae),傳染性軟腐病病毒科(Iflaviridae),星狀病毒科(Astroviridae),番茄叢矮病毒科(Tombusviridae), 杯狀病毒科(Caliciviridae)及未分科病毒和其他病毒。病毒群落分析提示：(1)腹瀉組病毒群落的組成和病毒滴度與健康對照組無明顯區(qū)別。(2)靈長類動物腹瀉糞便中可以感染哺乳動物的病毒主要為細小病毒和圓環(huán)病毒,但病毒滴度在兩組之間無明顯差異。(3)最近發(fā)現(xiàn)的picobirnaviridae病毒在靈長類動物腸道中廣泛存在。(4)星狀病毒不是本次研究的靈長類動物腹瀉的主要病因。(5)靈長類動物腸道內植物病毒種類多且病毒滴度高。(三)兒童與靈長類動物腸道病毒群落的比較本研究比較兒童與靈長類動物腸道病毒群落的組成,結果提示：(1)靈長類動物腸道病毒組成的多樣性高于兒童腸道病毒群落,靈長類動物腸道內病毒群落可以分為15個主要病毒科或者病毒種類,而兒童腸道病毒群落主要為9個病毒科或病毒種類組成。(2)靈長類動物腸道病毒群落中植物病毒占多數(shù),而兒童腸道病毒群落內感染哺乳動物的病毒占多數(shù)。原因可能是由兒童和靈長類動物的食物譜不同造成的。(3)總體上靈長類動物腸道內的病毒滴度高于兒童腸道內病毒。(四)兒童及靈長類動物腸道內新型病毒及腹瀉相關病毒的鑒定(1)腹瀉相關的新型星狀病毒本研究在兒童腸道病毒群落中發(fā)現(xiàn)了2種不同的新型星狀病毒(HAstV-JS1和HAstV-JS2),而在靈長類動物中發(fā)現(xiàn)了1種新型星狀病毒(MAstV-JS)。序列比對及系統(tǒng)進化分析表明本研究中3株星狀病毒與GenBank中星狀病毒毒株沒有近源毒株,說明該3株星狀病毒毒株為新型星狀病毒�；谠�3株毒株的特異性引物進行PCR檢測表明HAstV-JS1在腹瀉兒童群體的陽性率為12.20%,健康對照組樣品均為陰性。HAstV-JS2在腹瀉群體內的陽性率為10%(9/90),健康對照組樣品均為陰性。MAstV-JS在腹瀉靈長類動物群體的陽性率為3。5%(2/58),健康對照組均為陰性。提示本研究發(fā)現(xiàn)的3株新型星狀病毒與腹瀉有一定的相關性。(2)腹瀉相關的諾如病毒本研究在腹瀉兒童及靈長類動物群體的糞便樣品中檢測除了多個諾如病毒毒株。通過Geneious軟件de novo組裝成4個完整的基因組(NoV-JS1、NoV-JS2、 NoV-JS3和NoV-JS4)。4株諾如毒株與GenBank之前發(fā)現(xiàn)的毒株在核苷酸水平相似度大于95%,系統(tǒng)進化分析顯示NoV-JS1與廣州地區(qū)分離NoV毒株(KC894943)聚類,NoV-JS2與NoV-JS1所在的聚類群同處在同一個聚類群；NoV-JS3與另外1株廣州分離的NoV毒株(KF989075)緊密聚類；NoV-JS4與我國荊州地區(qū)的NoV(KF306214)緊密聚類。提示江蘇地區(qū)腹瀉兒童群體內有3種不同的NoV在兒童群體流行。利用Geneious軟件在靈長類動物腸道病毒群落中拼接l株諾如病毒全基因組序列。序列比對顯示該株諾如毒株與GenBank中提交的唯一1株靈長類動物的calicivirus序列相似度為85%；PCR檢測發(fā)現(xiàn)腹瀉靈長類動物糞便標本該病毒陽性率為10%,說明該杯狀病毒可能與靈長類動物的腹瀉有相關性。(3) Picornaviridae與Picobirnaviridae本研究顯示,在兒童腹瀉病毒群落中,picornaviridae與兒童腹瀉有一定的相關性。而在靈長類動物病毒群落中,picornaviridae家族的病毒與靈長類動物的腹瀉相關性不高。兒童腹瀉病毒群落內沒有發(fā)現(xiàn)picobirnaviridae,說明picobiranviridae與本次研究的兒童腹瀉無相關性。而在靈長類動物腹瀉組,picobirnaviridae家族的病毒與靈長類動物的腹瀉有一定的相關性。(4)新型戊型肝炎病毒樣新型病毒(Hepeliviridae)本研究在靈長類動物糞便樣品中發(fā)現(xiàn)1株新型戊型肝炎病毒樣病毒(命名為MHEV-JS)。MHEV-JS全基因組為7289bp,與人類HEV相似,該基因組主要編碼3個開放閱讀框,其衣殼蛋白與人HEV的相似度約30%�；赗dRp蛋白的氨基酸序列及病毒基因組的核苷酸堿基組成分析結果均顯示MHEV-JS屬于脊椎動物病毒,說明該病毒不是來自動物食入的植物病毒或昆蟲病毒�；赗dRp區(qū)設計一套巢式PCR檢測引物,RT-PCR檢測結果顯示7份靈長類動物糞便樣品為陽性,均來自同一個樣品采集點,其中5份來自腹瀉樣品,2份來自健康對照樣品,結果提示本研究中發(fā)現(xiàn)的新型HEV與靈長類動物的腹瀉沒有相關性。(5)圓環(huán)病毒及圓環(huán)病毒樣病毒本研究在兒童腸道病毒群落(GemyV-JS和CycV-JS)及靈長類動物腸道病毒群落(MGemyV-JS)內發(fā)現(xiàn)了3個具有環(huán)形基因組的單鏈DNA病毒。該3株圓環(huán)病毒樣病毒均含有1個Rep基因,編碼病毒的環(huán)形復制酶Rep,含有一個編碼病毒capsid衣殼蛋白的Cap基因。系統(tǒng)進化結果顯示：GemyV-JS與1株分離自Dragonfly的Germycircularvirus毒株聚類,它們的Rep蛋白在氨基酸水平相似度為49.4%；MGemyV-JS與分離自人類血液的Gemuycircularvirus聚類,它們的Rep蛋白在氨基酸水平相似度為48.5%。CycV-JS與其他Cyclovirus聚類在一起,其Rep蛋白在氨基酸水平相似度為56.3-58.9%�；谠�3株病毒基因組序列設計的PCR引物進行病毒基因檢測,發(fā)現(xiàn)該3株病毒的陽性樣品均只有1份,說明本研究中發(fā)現(xiàn)的3株環(huán)形DNA病毒均與腹瀉無明顯相關性。(6)靈長類動物新型腺病毒在靈長類動物病毒群落中發(fā)現(xiàn)1株新型腺病毒毒株(SAdV-Chl),本研究對該腺病毒毒株進行了全基因組測序,該毒株在基因組大小、基因組結構、堿基組成上與人類A型腺病毒相似,而與其他靈長類動物的腺病毒毒株明顯不同�；谌蚪M序列和病毒主要基因序列進行的系統(tǒng)進化分析,結果顯示該靈長類腺病毒毒株其他4株來自人A型腺病毒毒株緊密聚類形成一個單獨的分支,與其他靈長類腺病毒毒株遺傳關系較遠�；谙俨《救蚪M序列的重組分析表明SAdV-Ch1作親代毒株參與病毒基因同源重組,即由SAdV-ch1和HAdV-61作為母代毒株進行基因同源重組產生子代毒株HAdV-31.以上結果提示該靈長類腺病毒毒株具有跨種間傳播的潛在可能。結論：(1)本研究運用病毒宏基因組學方法成功解析了我國腹瀉兒童及靈長類動物群體的腸道病毒群落；(2)靈長類動物腸道病毒群落病毒種類多樣性高于兒童群體腸道病毒群落；(3)在兒童及靈長類動物腸道病毒群落內發(fā)現(xiàn)并鑒定了3株新型星狀病毒、1株新型戊型肝炎病毒樣病毒、3株圓環(huán)病毒樣病毒、1株新型腺病毒；(4)靈長類動物腸道病毒群落內的新型腺病毒具有跨種間傳播的潛在可能。
【關鍵詞】：病毒宏基因組學 兒童及靈長類動物 腹瀉 病毒群落 新型病毒 系統(tǒng)進化分析
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R725.7
【目錄】：

• 摘要6-11
• ABSTRACT11-16
• 英文縮略詞表16-20
• 第一章 緒論20-38
• 1.1 宏基因組學21-22
• 1.2 病毒宏基因組學概念的提出22-23
• 1.3 病毒宏基因組學的研究策略23-31
• 1.3.1 樣品處理23-24
• 1.3.2 DNA文庫的構建24-26
• 1.3.3 宏基因組文庫的高通量測序26-29
• 1.3.4 病毒宏基因組學產生的數(shù)據(jù)分析29-31
• 1.4 國內外相關研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢31-36
• 1.4.1 病毒群落的研究及新型病毒的鑒定31-33
• 1.4.2 病毒宏基因組學在病毒群落和新病毒發(fā)現(xiàn)上的應用33-36
• 1.5 研究目的與意義36-37
• 1.6 本研究的總體技術路線37-38
• 第二章 兒童及靈長類動物腹瀉腸道病毒群落組成及比較38-78
• 2.1. 材料與方法38-51
• 2.1.1 研究樣品的采集38-40
• 2.1.1.1 兒童糞便樣品采集38-39
• 2.1.1.2 靈長類糞便樣品采集39-40
• 2.1.2 重要試劑和酶類40-41
• 2.1.3 糞便樣品的前處理41
• 2.1.4 糞便樣品的核酸酶消化41-42
• 2.1.5 核酸的提取42-43
• 2.1.6. 樣品組合設計43-44
• 2.1.7 反轉錄和雙鏈DNA合成44
• 2.1.8 高通量測序文庫的構建44-48
• 2.1.8.1 雙鏈DNA的Tagmentation45-46
• 2.1.8.2 Index的添加及擴增、46-48
• 2.1.9 文庫的純化及DNA長度分布的優(yōu)化48-49
• 2.1.9.1 文庫中Index二聚體的去除48
• 2.1.9.2 文庫DNA分布的優(yōu)化48-49
• 2.1.10 文庫質量檢測49
• 2.1.11 將文庫的Miseq深度測序49-50
• 2.1.12 深度測序結果的生物信息學分析50-51
• 2.2. 實驗結果51-75
• 2.2.1 病毒宏基因組學深度測序DNA文庫的質量檢測51-53
• 2.2.1.1 文庫DNA分布結果51
• 2.2.1.2 文庫的Bioanalyzer檢測結果51-53
• 2.2.2 Miseq測序結果53-55
• 2.2.3 病毒宏基因組學分析結果55-75
• 2.2.3.1 兒童腸道病毒群落55-64
• 2.2.3.2 靈長類動物病毒群落的組成64-70
• 2.2.3.3 兒童與靈長類動物腸道病毒群落的比較70-72
• 2.2.3.4 兒童及靈長類動物腹瀉組與健康對照組腸道病毒群落比較72-75
• 2.3. 討論75-78
• 第三章 兒童及靈長類動物群體病毒腹瀉相關遺傳關系分析78-124
• 3.1. 材料與方法79-91
• 3.1.1 糞便樣品及處理79
• 3.1.2 病毒核酸的提取79-80
• 3.1.3 RNA病毒核酸的逆轉錄80-81
• 3.1.4 腹瀉相關及新型病毒PCR檢測引物81-86
• 3.1.4.1 基于本研究中發(fā)現(xiàn)的病毒基因序列的特異性引物設計如下表81-82
• 3.1.4.2 新型腺病毒基因組測序所用引物82-86
• 3.1.5 特定病毒的PCR檢測86-88
• 3.1.5.1 PCR反應體系86
• 3.1.5.2 PCR反應參數(shù)86-87
• 3.1.5.3 PCR產物的電泳檢測87
• 3.1.5.4 PCR反應產物的回收與純化87-88
• 3.1.6 特定病毒目的基因的克隆測序88-89
• 3.1.6.1 PCR產物的T/A連接88
• 3.1.6.2 細菌感受態(tài)細胞的制備88-89
• 3.1.6.3 連接產物轉化感受態(tài)細菌及培養(yǎng)89
• 3.1.7 病毒全基因組的de novo assembly89-90
• 3.1.8 基于病毒基因組或蛋白質序列的系統(tǒng)進化分析90-91
• 3.1.8.1 序列檢索及篩選90
• 3.1.8.2 系統(tǒng)進化分析90-91
• 3.1.9 病毒基因組重組研究91
• 3.2. 結果91-121
• 3.2.1 星狀病毒(Astroviridae)91-97
• 3.2.1.1 本研究中星狀病毒的基因組結構分析92-94
• 3.2.1.2 本研究中3株星狀病毒的遺傳關系94-97
• 3.2.2 杯狀病毒科97-101
• 3.2.2.1 札幌病毒(Sapovirus)97-99
• 3.2.2.2 諾如病毒(Norovirus)99-101
• 3.2.3 Picornaviridae與Picobirnaviridae101-103
• 3.2.4 戊型肝炎病毒樣新型病毒(Hepeliviridae)103-110
• 3.2.5 圓環(huán)病毒及圓環(huán)病毒樣病毒110-112
• 3.2.6 腺病毒(Adenovirus)112-121
• 3.2.6.1 新型腺病毒的基因組結構113-115
• 3.2.6.2 新型腺病毒與其他人及靈長類動物腺病毒的遺傳關系115-119
• 3.2.6.3 基于基因組水平的病毒重組分析119-120
• 3.2.6.4 基因腺病毒基因序列的特異性引物檢測120-121
• 3.3. 討論121-124
• 第四章 主要結論與展望124-126
• 4.1 主要結論及創(chuàng)新點124-125
• 4.2 展望125-126
• 參考文獻126-144
• 致謝144-145
• 在學期間發(fā)表的學術論文及其他科研成果145-146
• 學術論文145
• 主持、參與課題145-146
• 獲獎及專利授權情況146

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7 顧希W，

本文編號：1060801