本文關(guān)鍵詞：DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因CSB-PGBD3、MSH5和FMHR1在卵巢早衰發(fā)病中的作用機制研究

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【摘要】：第一章DNA損傷修復(fù)因子CSB-PGBD3在卵巢早衰發(fā)病中的作用機制研究第一節(jié)中國漢族卵巢早衰家系的全外顯子組測序研究目的：目前卵巢早衰的遺傳學(xué)研究主要依賴于模式動物及散發(fā)性POF病例的基因突變篩查,但進展緩慢�；蚪M學(xué)技術(shù)的發(fā)展為尋找疾病易感位點和候選基因提供了更高效精準(zhǔn)的手段,因此,本研究擬通過高覆蓋率的全外顯子組測序技術(shù),以POF家系為研究對象,希望發(fā)現(xiàn)新的POF致病基因。方法：在中國漢族非近親婚配家系POF-1中分別選取POF患者、致病基因疑似攜帶者和非攜帶者,使用illumina測序平臺進行全外顯子組測序,所獲結(jié)果與hg19數(shù)據(jù)庫進行序列對比,并按照常染色體顯性遺傳方式進行候選基因篩選,然后在其他成員中通過Sanger測序進行驗證,并在432例散發(fā)性POF患者和400例正常對照中進行候選基因突變篩查。結(jié)果：在POF-1家系的全外顯子組測序中,我們發(fā)現(xiàn)了符合常染色體顯性遺傳規(guī)律的錯義突變PGBD3 c.2237GA (p.G746D)。由于轉(zhuǎn)座子基因PGBD3能夠插入CSB基因形成CSB-PGBD3融合基因,因此我們在432例散發(fā)性POF患者和400例正常對照中對CSB-PGBD3進行了基因突變篩查,繼而又發(fā)現(xiàn)了雜合錯義突變C.3166GA (p.V1056I)和雜合無義突變c.643GT (p.E215X)。結(jié)論：首次發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3基因突變與家族性和散發(fā)性POF密切相關(guān),為POF致病機制研究提供了新的方向。高通量的全外顯子組測序技術(shù)也為POF的遺傳學(xué)研究提供了有力的技術(shù)支持。第二節(jié)CSB-PGBD3基因突變對DNA損傷修復(fù)功能的影響目的：通過對POF-1家系進行全外顯子組測序研究,我們發(fā)現(xiàn)了POF候選致病基因CSB-PGBD3。PGBD3是靈長類動物特有的轉(zhuǎn)座子基因,它可以插入CSB基因形成CSB-PGBD3融合基因,并表達CSB-PGBD3融合蛋白。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3融合蛋白參與DNA損傷的轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)修復(fù),但該基因在生殖細胞中的作用及其對卵巢功能的影響尚無報道。本課題擬通過研究CSB-PGBD3融合蛋白在卵巢組織中的表達情況及突變對其DNA損傷修復(fù)功能的影響,探討CSB-PGBD3與卵巢早衰的關(guān)系及致病機制。方法：利用人和恒河猴的卵巢組織對PGBD3和CSB-PGBD3融合蛋白進行卵巢組織定位。通過clonogenic survival實驗檢測CSB-PGBD3基因突變對細胞存活的影響。通過laser irradiation和H2O2損傷實驗明確CSB-PGBD3的DNA損傷修復(fù)功能。通過對比野生型和突變型CSB-PGBD3與RNAPol Ⅱ等DNA損傷修復(fù)因子的相互作用,探討CSB-PGBD3參與DNA損傷修復(fù)的具體機制及突變對其功能的影響。結(jié)果：通過在卵巢組織中的定位研究,我們發(fā)現(xiàn)PGBD3和CSB-PGBD3融合蛋白在靈長類動物各級卵泡的卵母細胞核中特異性表達。通過多種DNA損傷修復(fù)實驗,我們發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3能夠通過與RNApol Ⅱ結(jié)合,參與DNA損傷的轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)修復(fù)機制。此外,CSB-PGBD3能夠上調(diào)XPA、DDB1等DNA損傷修復(fù)因子的表達,促進更廣泛的DNA修復(fù)。我們所發(fā)現(xiàn)的3種突變均不同程度地影響了CSB-PGBD3的DNA損傷修復(fù)功能。結(jié)論：CSB-PGBD3融合蛋白是卵母細胞重要的DNA損傷修復(fù)因子,CSB-PGBD3基因突變導(dǎo)致的卵母細胞DNA損傷修復(fù)功能障礙可能是POF的致病機制之一。第二章DNA損傷修復(fù)因子MSH5在卵巢早衰發(fā)病中的作用機制研究目的：MSH5是重要的減數(shù)分裂相關(guān)基因,促進同源重組過程中Holliday Junction的形成和穩(wěn)定,對第一次減數(shù)分裂前期聯(lián)會復(fù)合體的形成和配子發(fā)生具有重要作用。本研究的目的是探討MSH5基因突變與卵巢早衰的相關(guān)性及其致病機制。方法：通過對中國漢族非近親婚配家系POF-2進行全外顯子組測序,并在432例散發(fā)性POF患者中進行驗證,我們發(fā)現(xiàn)了MSH5基因突變。利用RT-PCR和免疫組化在人和恒河猴的卵巢組織中進行MSH5表達定位；通過clonogenic survival實驗檢測野生型和突變型MSH5蛋白對細胞存活的影響；利用依托泊苷(ETO)誘導(dǎo)細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂,并通過檢測γH2AX水平,分析突變對MSH5的DNA損傷修復(fù)功能的影響；同時,結(jié)合文獻信息和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測模型,分析MSH5基因突變對卵巢功能的影響及其在POF發(fā)病中的作用。結(jié)果：通過對POF-2家系進行全外顯子組測序研究,我們發(fā)現(xiàn)了位于MSH5基因的純合錯義突變c.1459GT(p.D487Y),散發(fā)性POF患者中未發(fā)現(xiàn)該突變。通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測模型分析,我們發(fā)現(xiàn)突變p.D487Y位于MSH5的DNA結(jié)合功能域內(nèi),該位點從酵母到人類高度保守,酵母的同源位點突變可嚴(yán)重影響孢子生成。通過在卵巢組織中的定位研究,我們發(fā)現(xiàn)MSH5蛋白不僅在胚胎期的卵巢組織中高表達,而且在發(fā)育期卵泡的卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞中表達。野生型MSH5蛋白能夠促進ETO誘導(dǎo)的DNA雙鏈損傷的修復(fù),而突變型MSH5的功能喪失。結(jié)論：MSH5基因突變與家族性POF密切相關(guān)。MSH5廣泛表達于卵巢的卵母細胞及其支持細胞中,MSH5基因突變可能通過DNA同源重組修復(fù)機制障礙引起卵母細胞及其支持細胞的過度凋亡,卵泡異常閉鎖,最終導(dǎo)致卵巢早衰的發(fā)生。第三章FMR1基因前突變與中國漢族卵巢早衰的相關(guān)性研究目的：卵巢早衰的遺傳學(xué)病因有很大的地域和種族差異。FMR1基因前突變在高加索散發(fā)性POF患者中的發(fā)生率為3.3%-6.7%,被認為是POF的重要致病基因。FMR1前突變攜帶者的后代容易發(fā)生FMR1全突變,導(dǎo)致脆性X綜合征的發(fā)生,因此POF患者被推薦進行FMR1突變篩查。但是,FMR1前突變在中國漢族POF人群中的攜帶情況尚無報道,FMR1突變篩查的必要性有待探討。因此,本研究擬通過在中國漢族POF患者中進行FMR1基因突變篩查,明確FMR1前突變與中國漢族POF的相關(guān)性,為遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供理論依據(jù)。方法：選取379例中國漢族散發(fā)性POF患者和402例正常對照參與實驗,以外周血基因組DNA為模版,使用熒光標(biāo)記引物進行PCR擴增,并通過毛細管電泳檢測FMR1 5’UTR的CGG重復(fù)次數(shù)。同時,分析閉經(jīng)年齡與FMR1基因CGG重復(fù)次數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果：FMR1前突變在中國漢族散發(fā)性POF患者中的發(fā)生率僅為0.5%(2/379),遠低于高加索人群。FMR1中間型(CGG重復(fù)41-54次)在POF患者中的發(fā)生率略高于正常對照,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2.9% vs.1.7%,P=0.343)。POF患者的FMR1兩等位基因均比正常對照多一個CGG重復(fù)(allele-1:29.7 vs. 28.8, P0.001; allele-2:32.6 vs.31.5, P0.001)。攜帶FMR1純合突變型的POF患者比正常基因型攜帶者的閉經(jīng)年齡提前約4-6年(hom-high/high vs. norm： 20.4±4.8 vs.24.7±6.4, P0.01; hom-low/high vs. norm:18.7±1.7 vs.24.7±6.4, P0.01)。結(jié)論：FMR1基因前突變不是中國漢族POF的常見病因,然而,當(dāng)FMR1兩等位基因的CGG重復(fù)次數(shù)同時超出正常范圍(26-34)時,攜帶者的卵巢功能可能出現(xiàn)過早衰竭。
【關(guān)鍵詞】：卵巢早衰 家系研究 全外顯子組測序 CSB-PGBD3 POF DNA損傷修復(fù) CSB-PGBD3 RNApol Ⅱ 轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)修復(fù) 家族性POF MSH5 減數(shù)分裂 同源重組 FMR1 前突變 POF 中國漢族人種
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R711.75
【目錄】：

• 論文綱要8-10
• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 符號說明19-21
• 第一章 DNA損傷修復(fù)因子CSB-PGBD3在卵巢早衰發(fā)病中的作用機制研究21-49
• 第一節(jié) 中國漢族卵巢早衰家系的全外顯子組測序研究21-29
• 研究背景21-22
• 材料與方法22-27
• 結(jié)果27-28
• 討論28
• 結(jié)論28-29
• 第二節(jié) CSB-PGBD3基因突變對DNA損傷修復(fù)功能的影響29-49
• 研究背景29-30
• 材料與方法30-43
• 結(jié)果43-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 第二章 DNA損傷修復(fù)因子MSH5在卵巢早衰發(fā)病中的作用機制研究49-63
• 研究背景49-50
• 材料與方法50-59
• 結(jié)果59-60
• 討論60-62
• 結(jié)論62-63
• 第三章 FMR1基因前突變與中國漢族卵巢早衰的相關(guān)性研究63-68
• 研究背景63-64
• 材料與方法64-66
• 結(jié)果66
• 討論66-67
• 結(jié)論67-68
• 附錄和附圖68-88
• 參考文獻88-97
• 致謝97-98
• 攻讀學(xué)位期間科研成果目錄98-99
• 外文論文99-126
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表126

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