本文關(guān)鍵詞：miRNA-486-5p抗肺纖維化作用及其機(jī)制

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【摘要】：microRNAs (miRNAs)是一類(lèi)小分子非編碼RNAs,通常通過(guò)與靶mRNA3'端非翻譯區(qū)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合,導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。自從在秀麗隱桿線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)第一種miRNA以來(lái),目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾千種miRNAs,其中人類(lèi)miRNAs種類(lèi)已經(jīng)超過(guò)2500種(miRbase v21) (http://www.mirbase.org/) 。 miRNAs調(diào)控著多種生理過(guò)程(包括發(fā)育、增殖、分化凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等)中重要功能基因的表達(dá)。當(dāng)前研究表明,不同疾病具有特異的miRNA表達(dá)譜,如癌癥、炎癥、感染和自身免疫性疾病等。在多種動(dòng)物模型中,通過(guò)敲除和敲入功能性miRNA的研究也進(jìn)一步證實(shí)miRNA表達(dá)失調(diào)與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。肺纖維化是一類(lèi)由多種病因引起的肺組織損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、肺組織結(jié)構(gòu)異常重塑的不可逆性疾病,包括塵肺病和特發(fā)性肺纖維化,由于其纖維化確切的分子機(jī)制尚不完全清楚,目前缺乏特效的治療方法。因此,研究肺纖維化進(jìn)程中miRNA的作用及其機(jī)制將為肺纖維化疾病的診斷和治療提供新的線索。我們觀察分析矽肺動(dòng)物模型不同時(shí)期肺組織中miRNA表達(dá)譜的變化,通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)5種miRNAs與肺纖維化密切相關(guān),接著我們選擇了miRNA-486-5p進(jìn)行深入研究,探討其在纖維化中可能的作用機(jī)制及作為肺纖維化治療靶標(biāo)的潛在可能性。目的(1)通過(guò)分析矽肺動(dòng)物模型不同時(shí)期肺組織中miRNA表達(dá)譜變化,篩檢并驗(yàn)證出一組與矽肺發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNAs;(2)通過(guò)miR-486-5p模擬物干預(yù)矽塵和博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化,明確miR-486-5p的抗纖維化作用；(3)在細(xì)胞和分子水平上初步闡明miR-486-5p抗纖維化作用的分子機(jī)制。最終為肺纖維化治療靶標(biāo)提供新的線索。方法用氣管灌注方法構(gòu)建矽塵及博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化動(dòng)物模型；根據(jù)病理切片結(jié)果選取矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維動(dòng)物模型不同時(shí)間點(diǎn)各一只小鼠肺組織,提取RNA,用芯片法檢測(cè)miRNAs,分析并篩檢出一組差異表達(dá)明顯的miRNAs;用qRT-PCR法在矽塵及博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型中進(jìn)一步驗(yàn)證篩檢出的miRNAs(各時(shí)間段6只小鼠肺組織)；qRT-PCR方法檢測(cè)矽肺患者血清及肺組織中、特發(fā)性肺纖維化患者肺組織中miR-486-5p表達(dá)水平；尾靜脈注射miR-486-5p模擬物(agomiR-486-5p)干預(yù)矽塵和博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化,肺組織病理切片HE染色、Masson染色、免疫組織化學(xué)染色(a-SMA)及纖維化評(píng)分評(píng)價(jià)干預(yù)效果；通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-486-5p的直接靶基因；采用qRT-PCR、蛋白免疫印跡方法檢測(cè)高、低表達(dá)miR-486-5p對(duì)成纖維細(xì)胞活性的影響；采用CCK-8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)觀察miR-486-5p對(duì)TGF-β1所致的成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果1. 篩檢并驗(yàn)證矽肺動(dòng)物模型不同時(shí)間段肺組織中差異表達(dá)的miRNAs采用氣管灌注的方法構(gòu)建矽塵及博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化動(dòng)物模型,然后通過(guò)芯片篩檢矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化動(dòng)物模型中各時(shí)間點(diǎn)(0天、3天、7天、14天、28天和56天)肺組織中miRNA表達(dá),分析其變化,選擇了17種變化明顯的miRNAs,分別在矽塵和博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型的小鼠肺組織中進(jìn)行驗(yàn)證(每組6只小鼠),發(fā)現(xiàn)5種miRNAs與肺纖維化相關(guān)：miR-151-3p、 miR-21、miR-455、miR-486-5p及miR-3107,其中僅miR-21上調(diào),其余miRNAs均呈下調(diào)。2. miR-486-5p能夠抵抗矽塵和博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化我們選擇了miR-486-5p進(jìn)行后續(xù)的研究,首先檢測(cè)了矽肺患者血清中miR-486-5p的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)其明顯低于對(duì)照組,且壹期、貳期和叁期矽肺患者血清miR-486-5p表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組。之后又檢測(cè)了矽肺和特發(fā)性肺纖維化患者肺移植后病變肺組織中miR-486-5p的表達(dá)水平,也發(fā)現(xiàn)均明顯低于正常對(duì)照肺組織。因此,我們假設(shè)提高miR-486-5p的表達(dá)能夠抑制肺纖維化。于是,我們用膽固醇修飾的miR-486-5p模擬物(agomiR-486-5p)干預(yù)矽塵和博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化,28天肺組織病理切片HE染色及纖維化病理評(píng)分均顯示miR-486-5p干預(yù)組比矽塵和博來(lái)霉素組肺纖維化程度明顯減輕,Masson染色結(jié)果顯示干預(yù)組膠原沉積減少,免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示干預(yù)組a-SMA表達(dá)水平降低,以上結(jié)果均提示在整體動(dòng)物水平,過(guò)表達(dá)miR-486-5p可減輕矽塵和博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。3. miR-486-5p抑制肺纖維化可能的分子機(jī)制用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶基因,發(fā)現(xiàn)SMAD2和Co16α6為miR486-5p的潛在靶基因,我們用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-486-5p能與SMAD2和Col6a6的3'-UTR結(jié)合,但突變SMAD2和Col6α6 3'-UTR中預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)后,miR-486-5p不能與之結(jié)合,提示miR-486-5p可能是通過(guò)靶向調(diào)控這兩種靶基因發(fā)揮抑制肺纖維化作用的。為了驗(yàn)證miR-486-5p是否通過(guò)調(diào)控TGF-β1信號(hào)通路中重要分子SMAD2來(lái)影響肺纖維化發(fā)生發(fā)展的,我們先觀察了TGF-β1處理成纖維細(xì)胞后miR-486-5p的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)是下調(diào)的,并且肌成纖維細(xì)胞分化標(biāo)志物a-SMA及細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分纖粘蛋白(Fn)的mRNA水平均升高。然后,我們將miR-486-5p模擬物轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞中,構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-486-5p的細(xì)胞模型,用TGF-β1處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-486-5p能降低TGF-β1信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子P-SMAD2的蛋白表達(dá)水平,同時(shí)也降低了FN、CTGF及a-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)水平：而用miR-486-5p抑制劑構(gòu)建低表達(dá)細(xì)胞模型,則可增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的P-SMAD2蛋白水平,同時(shí)也增強(qiáng)了FN、CTGF及α-SMA蛋白及mRNA的表達(dá)水平。提示過(guò)表達(dá)miR-486-5p能抑制成纖維細(xì)胞增殖與分泌活性,下調(diào)miR-486-5p則減輕了對(duì)SMAD2的抑制水平,也就是增強(qiáng)了TGF-β1信號(hào)通路,從而增強(qiáng)成纖維細(xì)胞增殖與分泌活性。這些結(jié)果均說(shuō)明miR-486-5p可能通過(guò)干預(yù)TGF-β1信號(hào)通路調(diào)控肺纖維化進(jìn)程。為了進(jìn)一步證明miR-486-5p對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性的影響,我們做了CCK-8實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,用TGF-β1處理成纖維細(xì)胞可促進(jìn)其增殖,而miR-486-5p可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-486-5p對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響,我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞周期,結(jié)果顯示TGF-β1可使處于S期細(xì)胞數(shù)量增加和G1期細(xì)胞數(shù)量減少,而miR-486-5p模擬物可逆轉(zhuǎn)TGF-β1對(duì)細(xì)胞周期的這種作用。提示miR-486-5p表達(dá)水平的確會(huì)影響TGF-β1信號(hào)的傳遞從而影響成纖維細(xì)胞的增殖與分泌活性。結(jié)論通過(guò)對(duì)矽肺動(dòng)物模型肺組織miRNA芯片篩檢與qRT-PCR驗(yàn)證,我們初步確定了5種miRNAs (miR-21上調(diào),miR-151-3平、miR-455、miR-486-5p和miR-3107下調(diào))與肺纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；miR-486-5p在矽肺患者血清及肺組織中、特發(fā)性肺纖維化患者肺組織中表達(dá)明顯下調(diào)；高表達(dá)miR-486-5p可減輕矽塵和博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化；在細(xì)胞水平初步闡明miR-486-5p可通過(guò)TGF-β1信號(hào)通路參與肺纖維化進(jìn)程的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究的重要發(fā)現(xiàn)是miR-486-5p可能可以作為肺纖維化疾病的治療靶標(biāo)之一。
【關(guān)鍵詞】：microRNAs miR-486-5p 肺纖維化 TGF-β1 SMAD2 Col6α6
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R563
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 前言16-21
• 材料與方法21-45
• 結(jié)果45-67
• 討論67-73
• 全文小結(jié)73-74
• 參考文獻(xiàn)74-85
• 文獻(xiàn)綜述85-116
• 參考文獻(xiàn)100-116
• 發(fā)表文章、參加會(huì)議、培訓(xùn)及獲獎(jiǎng)情況目錄116-119
• 致謝119-120

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 Tianzhi Huang;Angel Alvarez;Bo Hu;Shi-Yuan Cheng;;Noncoding RNAs in cancer and cancer stem cells[J];Chinese Journal of Cancer;2013年11期

2 楊真真;李勇;;消化系統(tǒng)惡性腫瘤中S100A9的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2013年22期

3 劉洋;許新華;;miRNAs與鼻咽癌研究新進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年04期

4 李剛;龔權(quán);;肝纖維化信號(hào)傳導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年03期

5 王國(guó)振;王新穎;;髓源性抑制細(xì)胞促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的非免疫學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年07期

6 劉錕榮;韋宜賓;陳國(guó)忠;;Wnt/β-catenin、TGF-β/Smads及RAS/MARK信號(hào)通路與大腸癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年17期

7 李曉怡;盧忠心;;miRNA與心血管疾病研究進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2014年21期

8 Linlin Pan;Wei Gong;Yuanyuan Zhou;Xiaonuan Li;Jun Yu;Songnian Hu;;A Comprehensive Transcriptomic Analysis of Infant and Adult Mouse Ovary[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2014年05期

9 Qi Zhao;Jiang-Yue Zhao;Jin-Song Zhang;;Influence of bone morphogenetic protein type IA receptor conditional knockout in lens on expression of bone morphogenetic protein 4 in lens[J];International Journal of Ophthalmology;2015年01期

10 鐘慧鈺;宋興勃;周娟;胡雪姣;周易;葉遠(yuǎn)馨;陸小軍;王軍;周燕虹;應(yīng)斌武;;調(diào)控miRNA成熟通路的相關(guān)基因多態(tài)性與四川漢族人群胃癌的相關(guān)性研究[J];中國(guó)輸血雜志;2015年04期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王魏;聚L-谷氨酸/殼聚糖材料在脂肪組織工程以及膽管癌三維培養(yǎng)模型中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2013年

2 母小新;TGF-β信號(hào)通路參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

3 張婷婷;hsa-miR-30b在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)及功能的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

4 張明慧;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移及自噬凋亡的調(diào)控作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 王志強(qiáng);人孤雌胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為腸上皮干細(xì)胞的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

6 程敏;干擾素調(diào)節(jié)的miRNA表達(dá)譜及其抗HCV機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

7 申亮亮;NDRG2在結(jié)腸癌演變中對(duì)TGF-β通路功能的影響及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

8 張彪;NADPH氧化酶4是一個(gè)藥物干預(yù)腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)[D];浙江大學(xué);2013年

9 周暢;MicroRNA-339-5p/3p在結(jié)直腸癌中作用的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

10 肖科;VEGF-A，，VEGF-C及MMP-2表達(dá)調(diào)控膽管癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];中南大學(xué);2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李素仙;活性維生素D_3對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)TGF-β_1/Smads信號(hào)軸核酸表達(dá)的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2013年

2 徐榮偉;TGF-β1、VEGF表達(dá)與大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系[D];山東大學(xué);2013年

3 侯仰坤;50歲以上無(wú)癥狀人群大腸癌的篩查及miR-21、miR-143與大腸癌相關(guān)性研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

4 馬良驍;建鯉BMP15、BMP2B基因克隆及其表達(dá)分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 李珊珊;胃癌檢測(cè)血漿miRNA分子標(biāo)志物研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

6 馬東宇;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合纈沙坦對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

7 楊洋;MicroRNA-134靶向Nanog基因調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)活性[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

8 王麗麗;GDF-15對(duì)Treg細(xì)胞分化和功能的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

9 楊秋s

本文編號(hào)：1058959