本文關(guān)鍵詞：孕期咖啡因暴露所致成年子代骨質(zhì)疏松易感的宮內(nèi)編程機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 咖啡因 骨質(zhì)疏松 腎素血管緊張素系統(tǒng) 成骨分化 代謝編程

【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種常見的骨代謝性疾病,具有骨量減少、骨力學(xué)強(qiáng)度減弱和骨折發(fā)生率高等特點(diǎn)。骨吸收增強(qiáng)或骨合成減少導(dǎo)致的骨重構(gòu)(bone remodeling)失衡是其主要發(fā)病原因。病理表現(xiàn)為骨皮質(zhì)變薄、骨小梁減少、變形、變細(xì)及排列紊亂,骨骼質(zhì)地疏松脆弱。據(jù)統(tǒng)計,在1980-2008年間,全國不同地域骨質(zhì)疏松發(fā)病率為6.6%-19.3%。我國骨質(zhì)疏松人口基數(shù)大,增長趨勢明顯。按照人口發(fā)展趨勢,預(yù)測到2020年我國骨質(zhì)疏松發(fā)病人數(shù)將超過1.5億,這將給社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)調(diào)查表明,孕期地塞米松暴露、吸煙、營養(yǎng)限制均可引起子代骨量降低,此外,低出生體重與成年后骨量丟失及骨質(zhì)疏松發(fā)病直接相關(guān)。提示,骨質(zhì)疏松具有胎兒起源。孕期多種不良環(huán)境(如外源物、飲酒、藥物等)可導(dǎo)致胎兒低出生體重和器官發(fā)育不良。實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果證實(shí)孕期咖啡因暴露(prenatal caffeine exposure, PCE)可引起胎兒母源性糖皮質(zhì)激素過暴露,導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)。而且胎鼠長骨發(fā)育異常,表現(xiàn)為體長及長骨短小、初級骨化中心發(fā)育延遲。那么,孕期咖啡因所致的母源性高GC暴露引起胎骨組織宮內(nèi)發(fā)育不良的宮內(nèi)編程機(jī)制如何?宮內(nèi)發(fā)育不良的表現(xiàn)能否延續(xù)到出生后并最終引起骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生?2014年Nat Rev Endocrinol系列報道指出,母源性高GC過暴露可能是介導(dǎo)宮內(nèi)編程的關(guān)鍵因素。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)。越來越多的證據(jù)表明,RAS參與了骨質(zhì)發(fā)育的調(diào)控過程,RAS持續(xù)激活可導(dǎo)致成骨分化減少及骨質(zhì)疏松發(fā)生。提示,宮內(nèi)母源性GC過暴露可能通過慢性激活RAS,引起成骨分化抑制,此宮內(nèi)編程改變可延續(xù)至成年,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松易感。為此,本課題將建立孕期咖啡因暴露所致大鼠IUGR及其成年去勢刺激前后模型,系統(tǒng)研究IUGR胎兒在宮內(nèi)及成年去勢處理前后骨發(fā)育、RAS及其成骨分化能力的變化；進(jìn)一步從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度,探討在BMSCs模型上高GC與RAS及成骨分化能力之間的關(guān)系,以闡明咖啡因引起胎兒RAS功能發(fā)育變化的發(fā)生機(jī)制,解析骨質(zhì)疏松癥的胎兒發(fā)育起源,充分認(rèn)識成年骨質(zhì)疏松癥新的危險因素,指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。第一部分孕期咖啡因暴露所致的IUGR子代成年骨質(zhì)疏松癥易感現(xiàn)象及機(jī)制目的：通過整體動物實(shí)驗(yàn),證實(shí)孕期咖啡因暴露可致IUGR胎鼠成年后骨RAS激活和骨質(zhì)疏松癥易感。方法：建立孕中晚期咖啡因(120mg/kg-d)暴露所致大鼠IUGR模型。仔鼠分為四組,正常對照組,咖啡因組,去勢對照組,咖啡因+去勢組(咖啡因去勢組)。去勢組仔鼠出生后5.5月(PM5.5)給予摘除雙側(cè)卵巢處理,所有大鼠7月處死,正常對照組及咖啡因組取膝關(guān)節(jié)下脛骨松質(zhì)骨,部分用于檢測血管緊張素Ⅱ含量,部分用于提取骨RNA,實(shí)時實(shí)時定量PCR技術(shù),檢測脛骨松質(zhì)骨RAS (ACE、AT1R和AT2R)的nRNA表達(dá)。去勢對照組及去勢咖啡因組取股骨全長,MicroCT檢測骨強(qiáng)度變化、骨相對體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(TB.N)、骨小梁孔隙(TB.SP)、骨小梁厚度(TB.TH)、骨連接密度(Conn.D.)和骨小梁連接度(SWI)。取膝關(guān)節(jié)下脛骨松質(zhì)骨部分提取骨RNA,采用實(shí)時實(shí)時定量PCR技術(shù),檢測脛骨松質(zhì)骨RAS (ACE、AT1R和AT2R)的mRNA表達(dá)。結(jié)果：孕期咖啡因(120mg/kg-d)暴露成年雌性大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下血管緊張素Ⅱ含量顯著升高(P0.05),骨ACE表達(dá)上調(diào)(P0.05)。與去勢對照組相比,孕期咖啡因(120mg/kg-d)暴露雌性成年大鼠在去勢模型誘導(dǎo)下骨強(qiáng)度降低,骨三維掃描顯示骨質(zhì)疏松程度加重,主要指標(biāo)表現(xiàn)為BV/TV值、TB.N數(shù)量減小,而TB.SP增大(P0.05), TB.Th、Conn.D、SWI值未發(fā)生明顯變化,脛骨松質(zhì)骨ACE的nRNA表達(dá)增加(P0.05)。結(jié)論：孕中晚期咖啡因(120mg/kg·d)暴露所致的IUGR仔鼠成年去勢處理前后骨RAS均處于活化狀態(tài),骨質(zhì)疏松易感性增加。第二部分 孕期咖啡因暴露所致胎鼠長骨發(fā)育遲緩及其宮內(nèi)編程機(jī)制目的：在咖啡因所致的IUGR胎鼠模型上,研究母源性GC過暴露對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖與成骨分化的影響及骨組織局部RAS的影響,證實(shí)胎骨存在初級骨化中心發(fā)育延遲及長骨發(fā)育不良的現(xiàn)象及細(xì)胞機(jī)制。方法：Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,每晚6時按雌：雄=2：1合籠,次晨觀察雌鼠陰栓或陰道涂片鏡檢,查到陰栓或精子之日為受孕0 d。受孕大鼠隨機(jī)分為兩組：孕期正常對照組和孕期咖啡因處理組,每組12只。孕期咖啡因處理組于孕11d起,以120mg/kg-d咖啡因灌胃,每日一次,連續(xù)給藥至出生前一天(GD20),異氟烷麻醉狀態(tài)下處死母鼠,選取部分IUGR雌性胎鼠,將骨化中心部分于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80攝氏度凍存,用于Elisa方法檢測血管緊張素Ⅱ的含量；部分長骨置于4%多聚甲醛中固定,用于制作病理切片；部分長骨骨化中心部分置于1mlTRIZOL中于-80攝氏度凍存,用于提取總RNA; HE染色和Von kossa染色技術(shù),檢測出生前胎鼠(GD20)初級骨化中心相對長度；實(shí)時實(shí)時定量PCR技術(shù),檢測胎骨初級骨化中心RAS (ACE、AT1R和AT2R)和成骨分化(Runx2、BGLAP、BSP、ALP)相關(guān)指標(biāo)的mRNA表達(dá)；其余正常組雌性胎鼠和咖啡因組IUGR雌性胎鼠,至出生后兩周(PW2)處死仔鼠,取長骨制作病理切片,檢測PW2幼鼠次級骨化中心發(fā)育狀態(tài),提取原代BMSCs用于細(xì)胞培養(yǎng),觀察在成骨分化模型下成骨分化基因的表達(dá)變化。結(jié)果：在咖啡因(120mg/kg-d)處理組,胎鼠初級骨化中心相對長度明顯縮短(P0.05)；血管緊張素Ⅱ含量明顯增高(P0.05)：胎骨初級骨化中心ACE表達(dá)明顯增高,AT1R/AT2R表達(dá)比顯著上調(diào)(P0.01),成骨分化相關(guān)基因(Runx2、BGLAP、ALP)表達(dá)下調(diào)(P0.05)；和正常對照組相比,咖啡因組出生后兩周幼鼠次級骨化中心發(fā)育不良(P0.05),在成骨分化的細(xì)胞培養(yǎng)模型中,咖啡因組BMSCs的成骨分化基因表達(dá)下調(diào)(P0.01,P0.05)。結(jié)論：孕期咖啡因暴露能通過“母源性GC過暴露”誘導(dǎo)骨RAS活化,使胎骨成骨分化能力降低,初級骨化中心發(fā)育遲緩,表現(xiàn)為長骨宮內(nèi)發(fā)育不良。出生后次級骨化中心發(fā)育延遲,同時幼鼠BMSCs成骨分化能力降低。第三部分GR/ACE介導(dǎo)了高濃度GC所致的BMSCs成骨分化功能抑制目的：在細(xì)胞水平,以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為代表,通過研究不同濃度的皮質(zhì)酮處理—GR表達(dá)增加—ACE表達(dá)增加—RAS活化—Runx2下調(diào)—成骨分化能力降低之間的內(nèi)在聯(lián)系,證實(shí)GR/ACE表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)咖啡因所致胎骨GC活化和成骨分化能力降低,并通過GR抑制劑米非司酮(5 uM)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑依那普利(5 uM)的使用,探討高GC引起RAS激活及成骨分化降低發(fā)生機(jī)制。方法：建立原代BMSCs體外培養(yǎng)系統(tǒng),分別以0～250+M皮質(zhì)酮,以高濃度皮質(zhì)酮(500 uM)和的血管緊張素抑制劑(5uM),以及高濃度皮質(zhì)酮1250和GR抑制劑米非司酮(5 uM)處理BMSCs 7天,實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)檢測BMSCs成骨分化條件下ACE、AT1R、AT2R和成骨分化相關(guān)的Runx2、 ALP、BSP以及骨鈣素的mRNA表達(dá)；結(jié)果：①不同濃度皮質(zhì)酮處理能顯著上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ACE的mRNA表達(dá)(P0.01,P0.05),同時使AT1R/AT2R表達(dá)比的上調(diào)(P0.01,P0.05)并可抑制成骨分化相關(guān)基因(Runx2、BGLAP、BSP、ALP)的表達(dá)(P0.05)。②GR抑制劑和ACEI的作用：GR抑制劑的使用可以顯著降低BMSCs的GR和ACE的mRNA表達(dá)(P0.01,P0.05);ACEI的使用可以逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮處理下BMSCs的ACE的mRNA表達(dá)的升高(P0.01,P0.05),且能逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮對成骨分化相關(guān)基因的Runx2、ALP、 BSP以及骨鈣素mRNA表達(dá)的下調(diào)作用(P0.01,P0.05)。結(jié)論：高GC環(huán)境(皮質(zhì)酮)可能通過增加激活BMSCs的GR表達(dá),引起ACE的增加,這種作用可以導(dǎo)致成骨分化相關(guān)基因Runx2、ALP、BSP以及骨鈣素的表達(dá)降低�？Х纫虮┞端赂逩C環(huán)境對胎骨的RAS的激活可能胎兒宮內(nèi)長骨發(fā)育不良的原因,也是最終引起IUGR及其成年骨質(zhì)疏松易感的宮內(nèi)發(fā)生起源。
【關(guān)鍵詞】：咖啡因 骨質(zhì)疏松 腎素血管緊張素系統(tǒng) 成骨分化 代謝編程
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R580
【目錄】：

• 中文摘要10-14
• ABSTRACT14-19
• 引言19-25
• 第一部分 孕期咖啡因暴露所致的IUGR子代成年骨質(zhì)疏松癥易感現(xiàn)象及機(jī)制25-37
• 材料與方法25-31
• 結(jié)果31-33
• 討論33-37
• 第二部分 孕期咖啡因暴露所致胎鼠長骨發(fā)育遲緩及其宮內(nèi)編程機(jī)制37-51
• 材料與方法37-45
• 結(jié)果45-47
• 討論47-51
• 第三部分 GR/ACE介導(dǎo)了高濃度GC所致的BMSCs成骨分化功能抑制51-65
• 材料與方法51-58
• 結(jié)果58-61
• 討論61-65
• 全文結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 綜述72-92
• 參考文獻(xiàn)85-92
• 攻博期間發(fā)表科研成果目錄92-93
• 致謝93

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