本文關(guān)鍵詞：氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥性及分子機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 銅綠假單胞菌 氟喹諾酮藥物 Ⅱ類拓?fù)洚悩?gòu)酶 外排泵 生物膜

【摘要】：研究背景:細(xì)菌耐藥性是當(dāng)今世界所面臨的緊迫公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,抗菌藥物的大量應(yīng)用是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性逐年增加的主要因素。WHO的調(diào)查顯示,耐藥細(xì)菌幾乎分布于全球的各個(gè)地區(qū),2015年3月27日美國(guó)公布抗擊耐藥細(xì)菌國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃。本文所研究的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA),是近年來(lái)心內(nèi)科植入手術(shù)(支架、起搏器)患者術(shù)后感染的主要病原菌。假單胞菌屬的代表菌株就是PA,是一種條件致病菌,在人的呼吸道、腸道、和皮膚等都有該菌存在,易導(dǎo)致醫(yī)院感染的發(fā)生。近年來(lái)我國(guó)衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示,銅綠假單胞菌排名處于院內(nèi)感染病原菌的前四位,在呼吸道分離的病原菌中,銅綠假單胞菌位居首位。近年來(lái)由于廣譜抗菌藥物的大量使用,致使PA對(duì)國(guó)內(nèi)常用抗菌藥物的敏感性逐年下降,多重耐藥和泛耐藥PA的分離率日漸增高,成為院內(nèi)嚴(yán)重的化膿性感染,尤其是敗血癥、肺膿腫、慢性支氣管炎、內(nèi)植物手術(shù)(心臟介入手術(shù)、人工關(guān)節(jié)植入手術(shù))后引起感染等重要的致病菌,由于PA耐藥機(jī)制復(fù)雜,治愈其引起的感染對(duì)臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。近20年來(lái)抗菌藥物喹諾酮類的發(fā)展十分迅速,由于該類藥物的劑型多、使用方便、抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn),常常被國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)生用于控制由病原體引起的感染性疾病中。因此,細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性呈下降趨勢(shì),對(duì)該類抗菌藥物耐藥病原菌的種類不斷增多。研究證實(shí)PA對(duì)喹諾酮類藥物敏感性下降的主要機(jī)制為:拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ,Ⅳ基因突變;主動(dòng)外排系統(tǒng)的調(diào)控基因高表達(dá)而致細(xì)菌主動(dòng)外排能力增強(qiáng);生物膜的形成和細(xì)菌外膜通透性改變。幾種耐藥機(jī)制單獨(dú)或共同作用引起PA對(duì)喹諾酮藥物的耐藥性增加。但是,PA對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性與喹諾酮類藥物使用時(shí)間、劑量之間的相關(guān)性、耐喹諾酮藥物PA的耐藥特點(diǎn)以及臨床在應(yīng)用喹諾酮藥物的周期內(nèi)對(duì)喹諾酮藥物敏感的PA對(duì)其耐藥機(jī)制的變化尚不十分清楚。目的:深入了解我院內(nèi)科系統(tǒng)PA感染情況和對(duì)喹諾酮藥物耐藥性流行狀況,提供可經(jīng)驗(yàn)用于本地區(qū)PA感染的抗菌藥物。研究PA對(duì)喹諾酮藥物耐藥性與喹諾酮類藥物使用劑量和使用周期之間的相關(guān)性、耐喹諾酮藥物PA的耐藥特點(diǎn)和具體機(jī)制,以及臨床在應(yīng)用喹諾酮藥物的周期內(nèi)對(duì)喹諾酮藥物敏感的PA產(chǎn)生耐藥機(jī)制的變化,為臨床推薦適合喹諾酮藥物治療PA感染的藥物劑量和使用周期,對(duì)預(yù)防和控制醫(yī)院感染給予指導(dǎo)。方法:1.所有病原菌的原始數(shù)據(jù)輸入WHONET5.4軟件,使用該軟件統(tǒng)計(jì)PA的標(biāo)本分布和耐藥率;各種藥物的DDD值來(lái)源于衛(wèi)生部抗菌藥物臨床應(yīng)用監(jiān)測(cè)網(wǎng)藥品字典,DDDs=某抗菌藥年消耗量(m)/該藥的DDD值,本研究抗菌藥物的使用頻度(DBD)用DDDs/100bed-days表示;研究抗菌藥物使用與其耐藥性間的關(guān)系使用斯皮爾曼相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。分析不同標(biāo)本中分離出的PA對(duì)常用抗菌藥物耐藥率之間的差異,使用ANOVA中的LSD(最小顯著差異法)。2.使用瓊脂稀釋法測(cè)定MIC值;PCR擴(kuò)增拓?fù)洚悩?gòu)酶基因(gyr A、gyr B、par C和par E),純化,測(cè)序;通過(guò)RT-PCR分析4種外排系統(tǒng)膜連接蛋白Mex A、Mex C、Mex E和Mex X表達(dá)量;使用χ2檢驗(yàn)分析基因突變和外排泵表達(dá)與耐藥性之間的關(guān)系。3.采用CIP、LEV和NOR的梯度濃度(0.5MIC、1MIC、2MIC和4MIC)MH肉湯與臨床分離的7株銅綠假單胞菌分別進(jìn)行體外培養(yǎng);采用E-test法和瓊脂稀釋法測(cè)定誘導(dǎo)后菌株的MIC值;PCR擴(kuò)增Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶基因,純化,測(cè)序;RT-PCR分析4種外排系統(tǒng)膜連接蛋白Mex A、Mex C、Mex E和Mex X基因的表達(dá)量;使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0,對(duì)誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后MIC值的比較采用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素方差分析(LSD),檢驗(yàn)三種不同濃度梯度抗菌藥物誘導(dǎo)后,銅綠假單胞菌MIC值的差別。以p0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.采用結(jié)晶紫染色和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)研究在體外與三種喹諾酮藥物不同濃度(0.5MIC、1MIC、2MIC和4MIC)誘導(dǎo)后銅綠假單胞菌生成生物膜能力的差別,采用單因素方差分析PA與三種不同濃度梯度抗菌藥物誘導(dǎo)后生物膜形成能力的差別。以p0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.我院PA在內(nèi)科患者中主要以呼吸道感染為主,占55.2%,呼吸道感染的PA對(duì)抗菌藥物耐藥率高于其它部位感染的該菌,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p0.05;九年間醫(yī)院PA對(duì)阿米卡星的耐藥率最低,2010年為6.3%;對(duì)頭孢他啶的耐藥率均保持在30%以下,其次為環(huán)丙沙星;但總體對(duì)所監(jiān)測(cè)其它抗菌藥物的敏感性較低。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)喹諾酮類藥物(左氧氟沙星、環(huán)丙沙星)和碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南)的用量與PA對(duì)其的耐藥率呈正相關(guān),p≤0.05。2.臨床呼吸道分離的150株P(guān)A,對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率最低為28.8%,對(duì)莫西沙星的耐藥率最為嚴(yán)重,耐藥率為96.3%,對(duì)左氧氟沙星和氧氟沙星次之,所分離菌株中有38株P(guān)A同時(shí)對(duì)所研究5種氟喹諾酮藥物均耐藥。3.38株對(duì)氟喹諾酮藥物耐藥PA中26株存在gyr A亞單位Thr83→Ile突變,3株有par C亞單位Ser80(TCG)-Ieu(TTG)突變,4株由于par C亞單位38位堿基的缺失,導(dǎo)致氨基酸的連續(xù)突變,未發(fā)現(xiàn)gry B和par E基因QRDR區(qū)的突變株;gyr A基因突變組與未突變組對(duì)CIP(p0.05),LEV(p0.001)的敏感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而對(duì)NOR(p0.05)的敏感性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.通過(guò)比較在加入和不加外排泵抑制劑PAβN兩種處理?xiàng)l件測(cè)得的MIC值,篩選出外排泵高表達(dá)表型陽(yáng)性的菌株共9株,陽(yáng)性率為23.7%(9/38);RT-PCR擴(kuò)增后,有6株P(guān)A外排基因mex A高表達(dá)。外排基因Mex E高表達(dá)的菌株有2株。未發(fā)現(xiàn)存在高表達(dá)外排基因Mex C和Mex X的菌株。5.7株P(guān)A與CIP、LEV和NOR不同濃度(0.5MIC、1MIC、2MIC、4MIC)共同培養(yǎng)后,PA對(duì)CIP的MIC值的變化是原菌株的2.5-160倍,對(duì)NOR的MIC值的變化是原菌株的4-32倍,對(duì)LEV的MIC的變化是原菌株的1-64倍;LSD統(tǒng)計(jì)分析,藥物濃度為4MIC時(shí)對(duì)三種氟喹諾酮類藥物MIC值影響與0.5MIC、1MIC和2MIC有差異,p0.05。NOR和LEV在藥物濃度為2MIC和4MIC時(shí)對(duì)誘導(dǎo)菌株MIC值有差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05;CIP與LEV和NOR之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05。6.三種氟喹諾酮藥物不同濃度誘導(dǎo)后PA,經(jīng)PCR擴(kuò)增,將其產(chǎn)物純化后的測(cè)序,其結(jié)果與Gen Bank中PAO1的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì),在Gry A亞單位的突變主要為83Thr-Gla(10株),72Asp-Gly(3株),87Asp-Asn(1株);4株有par C基因QRDR區(qū)發(fā)生80位氨基酸密碼子發(fā)生突變Ser80(TCG)-Ieu(TTG);未發(fā)現(xiàn)在Gry A和Par C的QRDR的其它突變;外排基因Mex C高表達(dá)的菌株占所有研究菌株的98.8%,其次為Mex X高表達(dá)的菌株45.23%,Mex E高表達(dá)的菌株為26.19%。未發(fā)現(xiàn)有Mex A的高表達(dá)株。7.結(jié)晶紫染色后,使用SM-Mk3酶標(biāo)儀在570nm單波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。在所測(cè)菌株中A5700.3占39.29%;0.3A5701.0占48.21%;A5701.0占12.50%;差異性分析藥物對(duì)不同菌株生物膜生成量之間(F=2.202,p=0.116),提示不同氟喹諾酮類藥物之間對(duì)臨床分離7株銅綠假單胞菌生物膜的生成無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05;差異性分析不同濃度之間的氟喹諾酮藥物對(duì)生物膜生成能力有顯著差異(p=0.000)。使用最小顯著差數(shù)法(LSD)分析,0.5MIC誘導(dǎo)后的臨床分離株對(duì)生物膜生成能力的影響與1MIC、2MIC和4MIC誘導(dǎo)后的菌株有顯著差異p=0.000,而其余三個(gè)濃度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05。8.對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)A生物膜的觀察分別在24h、48h、72h并采集圖像,未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的對(duì)照菌株生物膜形成在相同的觀察時(shí)間點(diǎn)上晚于經(jīng)過(guò)藥物誘導(dǎo)的菌株,在72h鏡下可見菌株仍疏松,經(jīng)過(guò)LEV誘導(dǎo)的菌株在24h菌落已聚集成較大的片狀生物膜,形成速度要高于CIP誘導(dǎo)的菌株。0.5MIC誘導(dǎo)后的菌株形成生物膜明顯強(qiáng)于4MIC誘導(dǎo)后的菌株。結(jié)論:1.PA耐藥率變化與氟喹諾酮藥物、碳?xì)涿瓜╊愃幬锸褂昧康脑黾映烧嚓P(guān);阿米卡星,頭孢他啶、環(huán)丙沙星可作為治療PA的經(jīng)驗(yàn)用藥;2.氟喹諾酮藥物耐藥的PA以Gyr A亞單位Thr83(ACC)→Ile(ATC)突變和外排基因mex A高表達(dá)為主;本研究在國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)par C亞單位38位堿基的缺失,使相應(yīng)氨基酸的錯(cuò)譯,導(dǎo)致PA對(duì)喹諾酮的耐藥;3.敏感的PA可在接觸抗菌藥物后產(chǎn)生耐藥性,外排基因Par C的高表達(dá)是其產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制;4.濃度為4MIC的氟喹諾酮藥物的使用,易造成多重耐藥的PA的形成;濃度為0.5MIC的氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)生物膜生成能力強(qiáng);5.推薦在治療敏感的PA引起的中重度感染時(shí),合用泵抑制劑會(huì)延緩PA耐藥的產(chǎn)生,應(yīng)足量短療程治療,減少突變株的產(chǎn)生。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 氟喹諾酮藥物 Ⅱ類拓?fù)洚悩?gòu)酶 外排泵 生物膜
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R446.5
【目錄】：

• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-20
• 常用縮寫詞中英文對(duì)照表20-21
• 前言21-24
• 第一部分 2002-2010 年醫(yī)院內(nèi)科系統(tǒng)分離銅綠假單胞菌耐藥性與抗菌藥物的使用的相關(guān)性研究24-37
• 引言24
• 1 材料與方法24-27
• 1.1 材料24-25
• 1.2 方法25-27
• 2 結(jié)果27-34
• 2.1 銅綠假單胞菌的構(gòu)成比27-28
• 2.2 常用抗菌藥物的使用量28-29
• 2.3 銅綠假單胞菌的耐藥率29-30
• 2.4 使用量與耐藥率相關(guān)性研究結(jié)果30-31
• 2.5 四類抗菌藥物的使用與耐藥性的關(guān)系31-34
• 3 討論34-36
• 4 結(jié)論36-37
• 第二部分 臨床分離銅綠假單胞菌耐氟喹諾酮藥物分子機(jī)制的研究37-71
• 引言37-39
• 第一節(jié) 臨床分離銅綠假單胞菌Ⅱ類拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變與耐藥性的關(guān)系39-55
• 1 材料與方法39-45
• 1.1 材料39-40
• 1.2 方法40-45
• 2 結(jié)果45-52
• 2.1 5 種氟喹諾酮的耐藥率45
• 2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖45-48
• 2.3 基因測(cè)序結(jié)果48-51
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果51-52
• 3 討論52-54
• 4 結(jié)論54-55
• 第二節(jié) 臨床分離銅綠假單胞菌4種外排泵高表達(dá)的分布與耐藥性關(guān)系的研究55-71
• 1 材料和方法55-60
• 1.1 材料55-56
• 1.2 方法56-60
• 2 結(jié)果60-68
• 2.1 主動(dòng)外排泵外排表型陽(yáng)性菌的篩選結(jié)果60-62
• 2.2 RNA含量與蛋白質(zhì)含量吸光度的比值62-63
• 2.3 外排泵基因檢測(cè)63-64
• 2.4 PCR擴(kuò)增曲線圖64-68
• 3 討論68-70
• 4 結(jié)論70-71
• 第三部分 氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥性及分子機(jī)制的研究71-93
• 引言71-72
• 第一節(jié) 不同濃度氟喹諾酮藥物體外誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥性的研究72-84
• 1 材料與方法72-76
• 1.1 材料72-73
• 1.2 方法73-76
• 2 結(jié)果76-82
• 2.1 MIC檢測(cè)結(jié)果76-77
• 2.2 誘導(dǎo)濃度確定77
• 2.3 誘導(dǎo)耐藥77-78
• 2.4 誘導(dǎo)前后抗菌藥物敏感性測(cè)定78-82
• 3 討論82-83
• 4 結(jié)論83-84
• 第二節(jié) 氟喹諾酮藥物體外誘導(dǎo)臨床分離銅綠假單胞菌基因突變和外排泵的研究 . 6484-93
• 1 材料與方法84-86
• 1.1 材料84-85
• 1.2 方法85-86
• 2 結(jié)果86-90
• 2.1 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果86
• 2.2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增86-87
• 2.3 誘導(dǎo)后菌株基因測(cè)序結(jié)果87
• 2.4 誘導(dǎo)后外排泵基因的表達(dá)87-90
• 3 討論90-92
• 4 結(jié)論92-93
• 第四部分 不同濃度氟喹諾酮藥物誘導(dǎo)銅綠假單胞菌生物膜形成的研究93-114
• 引言93-94
• 第一節(jié) 銅綠假單胞菌臨床生物膜形成的檢測(cè)94-104
• 1 材料和方法94-97
• 1.1 材料94-95
• 1.2 方法95-97
• 2 結(jié)果97-101
• 2.1 生物膜吸光度的測(cè)定97
• 2.2 生物膜生成能力的比較97
• 2.3 誘導(dǎo)后菌株生物膜形成能力比較97-101
• 3 討論101-103
• 4 結(jié)論103-104
• 第二節(jié) 激光共聚焦顯微鏡觀察誘導(dǎo)耐藥后銅綠假單胞菌生物膜的形成104-114
• 1 材料與方法104-107
• 1.1 材料104-105
• 1.2 方法105-107
• 2 結(jié)果107-111
• 2.1 生物膜圖像的采集107
• 2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果107-108
• 2.3 生物膜形成圖像108-111
• 3 討論111-113
• 4 結(jié)論113-114
• 參考文獻(xiàn)114-126
• 綜述126-143
• 參考文獻(xiàn)136-143
• 致謝143-144
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果144-145
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷145

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1044834