本文關(guān)鍵詞：胰島素抵抗大鼠腦組織損傷機(jī)制以及番茄紅素的保護(hù)作用研究

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【摘要】：研究背景機(jī)體組織在外界環(huán)境或者遺傳等因素的影響下可以表現(xiàn)出胰島素抵抗,其主要特征為胰島素敏感性降低,常伴隨高胰島素血癥和葡萄糖利用障礙。胰島素發(fā)揮其降糖作用的代謝信號途徑為：胰島素可與胰島素受體(insulin receptor, IR)和胰島素生長因子樣受體1(insulin-like growth factor, IGF-1R)結(jié)合,酪氨酸激酶被激活,使得胰島素受體底物磷酸化,并將下游底物蛋白磷酸化或去磷酸化,從而激活磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/AKT),活化的蛋白激酶B可以降低下游糖原合成酶的活性產(chǎn)生抑制作用,促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)以及糖原合成,使得血糖水平下降。胰島素抵抗主要是此信號途徑發(fā)生障礙所致。過去研究主要認(rèn)為肝臟、骨骼肌和脂肪組織等是胰島素發(fā)揮作用的靶器官,而中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)被認(rèn)為沒有胰島素發(fā)揮作用。近年來,隨著胰島素在腦組織的研究不斷深入,越來越多的研究認(rèn)為腦組織內(nèi)有胰島素信號分子的廣泛分布同時(shí)在腦內(nèi)可以檢測到胰島素信號通路分子的表達(dá)。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)與2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)風(fēng)險(xiǎn)增加正相關(guān),有研究提出稱AD為“3型糖尿病”。而胰島素信號通路受損正是T2DM與AD兩種疾病的共同發(fā)病機(jī)制之一,胰島素抵抗又是T2DM的核心特征,因此探索胰島素信號通路作用機(jī)制是明確胰島素抵抗與AD關(guān)系的關(guān)鍵基礎(chǔ)。胰島素抵抗被認(rèn)為是AD的重要危險(xiǎn)因素之一,已有研究表明胰島素抵抗可以造成腦內(nèi)Aβ沉積加重,但AD樣改變與胰島素抵抗相關(guān)的具體機(jī)制仍不明確。氧化應(yīng)激在包括T2DM和AD的多種病理過程的發(fā)生、發(fā)展中都起到了重要作用。氧化應(yīng)激可以造成糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)的過度產(chǎn)生,AGEs可以與其受體(receptor for AGEs, RAGE)結(jié)合,進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)中的核心因子轉(zhuǎn)錄核因子-KappaB (nuclear factor-kappa B, NF-κB),NF-κB參與調(diào)控許多炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-lbeta, IL-1β)。神經(jīng)炎癥同樣參與了AD等神經(jīng)退行疾病的病理發(fā)展,然而胰島素抵抗腦組織損傷中氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)兩方面的系統(tǒng)機(jī)制仍不明確。目前由于AD等神經(jīng)退行疾病的防治缺少有效、低毒的方法,具有藥理活性的天然藥物逐漸成為研究的焦點(diǎn),對于多病因、機(jī)制復(fù)雜的疾病往往起到“霰彈”效果。類胡蘿卜素家族中的番茄紅素是一種高效的天然抗氧化劑,其抗氧化能力大約是p-胡蘿卜素的47倍,維生素E的100倍。番茄紅素可以穿越“血腦屏障”進(jìn)入CNS發(fā)揮其抗氧化、清除自由基等生物學(xué)功能。近年來,關(guān)于番茄紅素在中樞神經(jīng)退行性疾病中的研究不斷增多,有研究顯示長期攝入番茄紅素有助于改善老年人群的認(rèn)知功能和記憶能力,番茄紅素在中樞神經(jīng)退行性疾病中的防治作用備受關(guān)注。因此探討胰島素抵抗模型中樞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子表達(dá)水平改變,以明確中樞胰島素抵抗機(jī)制,進(jìn)而從AGEs/RAGE、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)幾個(gè)方面系統(tǒng)全面的探討胰島素抵抗動(dòng)物模型腦組織損傷及番茄紅素保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制,可以為揭示AD等神經(jīng)退行疾病的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制并選擇有效的防治靶點(diǎn)提供理論依據(jù),同時(shí)探究天然藥物多效性的特點(diǎn),從而為從天然藥物寶庫中發(fā)掘有效預(yù)防和治療記憶減退的藥物提供現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價(jià)值。研究目的觀察胰島素抵抗大鼠胰島素敏感性、中樞胰島素信號通路蛋白表達(dá)水平的變化以及番茄紅素的干預(yù)作用；觀察胰島素抵抗大鼠腦組織認(rèn)知功能、AGEs/RAGE、抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)物、炎癥反應(yīng)因子、PPARy表達(dá)等變化以及番茄紅素對其的干預(yù)作用；進(jìn)一步探討胰島素抵抗腦組織損傷與AD相關(guān)的機(jī)制以及有效的治療靶點(diǎn)；探究番茄紅素多效性特點(diǎn),從天然藥物寶庫中發(fā)掘有效預(yù)防和治療記憶減退的藥物。研究方法1.動(dòng)物分組及胰島素抵抗動(dòng)物模型的建立6-8周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠32只,按空腹體重編號后隨機(jī)分為四組,其中包括CNTL組：正常對照組；F組：果糖喂養(yǎng)組；F+LYCO組：番茄紅素干預(yù)組；LYCO組：番茄紅素對照組。F組和F+LYCO組采用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng),同時(shí)給予10%的果糖水喂養(yǎng)16周,建立胰島素抵抗模型。F+LYCO組在16周果糖水喂養(yǎng)的后10周給予番茄紅素(4mg/kg)灌胃。LYCO組同期僅給予同劑量番茄紅素灌胃。2.胰島素抵抗等相關(guān)生理指標(biāo)的檢測喂養(yǎng)結(jié)束后檢測各組大鼠的體重、空腹血糖(fasting blood gluscose,FBG)與空腹胰島素(fasting insulin, FINS)水平,據(jù)此計(jì)算胰島素抵抗系數(shù)(HOMA-IR),即HOMA-IR= FBG×FINS/22.5,并以此明確外周胰島素抵抗是否成功建立。3.行為學(xué)檢測：藥物給予結(jié)束后采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來評估各組實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。前五天進(jìn)行航行訓(xùn)練實(shí)驗(yàn),第六天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將平臺隨機(jī)隱藏平臺預(yù)設(shè)于四象限之一并保持此位置,在航行訓(xùn)練試驗(yàn)中,頭兩天記錄分析大鼠到達(dá)可視平臺的時(shí)間,后三天記錄大鼠到達(dá)隱蔽的該平臺的時(shí)間,即逃避潛伏期。第六天開始空間探索實(shí)驗(yàn),撤掉平臺,記錄分析大鼠經(jīng)過平臺原始位置的次數(shù),記錄分析大鼠在平臺所處象限的時(shí)間和路程,并以此計(jì)算時(shí)間和路程在總時(shí)間及總路程中所占的比率。4.中樞胰島素信號通路分子的檢測取大鼠海馬及皮層,Western blot法分別分析IR、IGF-1R、PI3K、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylation of protein kinase B.p-AKT)及AKT等指標(biāo)在不同組別中的表達(dá)差異,以此明確中樞胰島素抵抗是否存在。5.組織病理學(xué)檢測蘇木素-伊紅(HE)染色檢測各組大鼠海馬及皮層的組織形態(tài)學(xué)改變。6. AGEs/RAGE系統(tǒng)檢測免疫組織化學(xué)法大鼠海馬與皮層AGEs含量變化；熒光定量RT-PCR測定各組大鼠海馬及皮層RAGE mRNA水平表達(dá)。7.氧化產(chǎn)物的檢測采用組織活性氧熒光定量(DCFH-DA)方法檢測各組大鼠海馬及皮層內(nèi)的活性氧(ROS)水平；采用丙二醛(MDA)測定法檢測各組大鼠海馬及皮層內(nèi)的脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation, LPO)水平；采用二硝基苯肼(DNPH)反應(yīng)法檢測蛋白羰基(protein carbonal content, PCC)含量。8.抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的檢測采用生化方法檢測各組大鼠腦組織海馬及皮層超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活性或含量。9.神經(jīng)炎癥因子的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測各組大鼠腦組織海馬及皮層NF-κB, TNF-α和IL-1β的表達(dá)。10.過氧化物酶體增殖體激活受體(PPAR γ)的檢測Western blot法檢測各組大鼠腦組織海馬及皮層PPARy蛋白水平表達(dá)。11.膽堿能系統(tǒng)活性檢測：采用生化方法檢測檢測各組大鼠腦組織海馬及皮層膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(AChE)和乙酰膽堿(ACh)的活性或含量變化。12.結(jié)果統(tǒng)計(jì)：運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,所有的結(jié)果都采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示,應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)和Turkey檢驗(yàn)分析組間差異,當(dāng)有兩個(gè)自變量進(jìn)行比較時(shí)采用兩因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.胰島素抵抗大鼠中樞胰島素信號通路的改變及番茄紅素的干預(yù)作用1.1番茄紅素改善了胰島素抵抗大鼠存在的胰島素敏感性異常F組及F+LYCO組各有一只大鼠因死亡或疾病排除出實(shí)驗(yàn)。各組大鼠體重與空腹血糖無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,CNTL組空腹胰島素水平為13.7±2.7mU/L,HOMA-IR為3.05±0.44。F組,即胰島素抵抗組,空腹胰島素水平為38.8±5.6mU/L(P0.01 vs正常對照組), HOMA-IR為9.12±0.6(P0.01 vs正常對照組)。F+LYCO組空腹胰島素水平為19.1±4.5 mU/L(P0.01 vs正常對照組；P0.05 vs胰島素抵抗組),HOMA-IR為4.19±0.33(P0.01 vs正常對照組；P0.05 vs胰島素抵抗組)。CNTL組與LYCO組之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1.2番茄紅素改善了胰島素抵抗大鼠中樞胰島素信號通路蛋白IR、IGF-1R、 PI3K、p-AKT及AKT等指標(biāo)表達(dá)的異常F組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)的IR、IGF-1R、PI3K及p-AKT的表達(dá)較CNTL組明顯降低。F+LYCO組海馬(P0.05)及皮層(P0.05)的IR、IGF-1R、PI3K及p-AKT的表達(dá)較F組明顯增高,F+LYCO組海馬(P0.05)及皮層(P0.05)的1R、IGF-1R、PI3K及p-AKT的表達(dá)仍低于CNTL組。CNTL組與LYCO組之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AKT在各組表達(dá)無明顯差異。2.番茄紅素對胰島素抵抗大鼠腦組織損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究2.1番茄紅素改善了胰島素抵抗大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的下降前五天的定向航行實(shí)驗(yàn)(分為2天的可視平臺實(shí)驗(yàn)和3天的隱蔽平臺實(shí)驗(yàn))反應(yīng)了大鼠學(xué)習(xí)能力,第六天空間探索實(shí)驗(yàn)反應(yīng)了大鼠的記憶能力。在2天的可視平臺實(shí)驗(yàn)中,各組的大鼠逃避潛伏期無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；在3天的隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)中,F組大鼠逃避潛伏期較CNTL組均明顯延長(P0.05),F+LYCO組較F組的逃避潛伏期明顯縮短(P0.05),CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。在空間探索實(shí)驗(yàn)中,F組大鼠經(jīng)過該平臺所在位置的次數(shù)較CNTL組顯著減少(P0.01),F+LYCO組大鼠經(jīng)過該平臺的次數(shù)較F組明顯增加(P0.01),CNTL組和LYCO組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；F組大鼠尋找該平臺所在位置所用的的路程和時(shí)間比例較CNTL組顯著減少(P0.01,P0.01),F+LYCO組大鼠尋找該平臺所在位置所用的的路程和時(shí)間比例較F組明顯增加(P0.01,P0.01),CNTL組和LYCO組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.2番茄紅素可以改善胰島素抵抗大鼠腦組織病理損傷在CNTL組和LYCO組,大鼠海馬及皮層神經(jīng)細(xì)胞排列整齊,數(shù)量較多,核仁較為明顯；F組大鼠海馬及皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,排列紊亂,出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮現(xiàn)象；F+LYCO組的情況介于CNTL組和F組之間。2.3番茄紅素對胰島素抵抗大鼠腦組織損傷的保護(hù)機(jī)制研究2.3.1番茄紅素可以下調(diào)胰島素抵抗大鼠AGEs/RAGE系統(tǒng)的表達(dá)F組大鼠海馬與皮層AGEs表達(dá)水平較CNTL組明顯升高(P0.05),F+LYCO組大鼠海馬與皮層AGEs表達(dá)水平較F組降低(P0.05),CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。F組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)RAGE mRNA水平較CNTL組明顯升高,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05) RAGE mRNA水平較F組降低,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)RAGE水平仍高于CNTL組,CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。2.3.2番茄紅素降低胰島素抵抗大鼠海馬及皮層氧化產(chǎn)物的生成F組大鼠海馬(P0.05,P0.01,P0.01)及皮層(P0.01,P0.01,P0.05)ROS、LPO和PCC水平較CNTL組明顯升高,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05,P0.05,P0.05)及皮層(P0.05,P0.05,P0.01)ROS水平較F組降低,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05,P0.05,P0.05)及皮層(P0.05,P0.05,P0.05)ROS水平仍高于CNTL組,CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。2.3.3番茄紅素提高胰島素抵抗大鼠海馬及皮層的抗氧化防御系統(tǒng)功能F組大鼠海馬(P0.01,P0.05,P0.05)及皮層(P0.05,P0.01,P0.05)SOD、CAT和GPx活性較CNTL組明顯降低,F+LYCO組大鼠海馬(P0.01,P0.05,P0.05)及皮層(P0.05,P0.05,P0.01)CAT和GPx活性較F組升高,F+LYCO組大鼠海馬(P0.01,P0.05,P0.05)及皮層(P0.05,P0.05,P0.01)SOD、CAT和GPx活性仍低于CNTL組,CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。F組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)GSH含量較CNTL組明顯降低,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)GSH含量較F組升高,F+LYCO組大鼠海馬(P0.01)及皮層(P0.05)GSH含量仍低于CNTL組,CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。2.3.4番茄紅素下調(diào)胰島素抵抗大鼠海馬及皮層炎癥因子的表達(dá)F組大鼠海馬(P0.05,P0.05,P0.01)及皮層(P0.05,P0.05,P0.01)的NF-κB、TNF-α口IL-1β水平明顯高于CNTL組,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05,P0.05,P0.01)及皮層(P0.05,P0.01,P0.05)的NF-κB、 TNF-a和IL-1 β水平低于F組,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05,P0.05,P0.05)及皮層(P0.01,P0.05,P0.05)的NF-κB、TNF-α和IL-1 p水平高于CNTL組,CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。2.3.5番茄紅素可以增強(qiáng)大鼠海馬及皮層PPARγ蛋白表達(dá)F組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)PPARγ蛋白表達(dá)較CNTL組明顯降低,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)PPARy蛋白表達(dá)較F組升高,F+LYCO組大鼠海馬(P0.01)及皮層(P0.05)PPARy蛋白表達(dá)仍低于CNTL組,CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。2.3.6番茄紅素可以改善胰島素抵抗大鼠海馬及皮層膽堿能系統(tǒng)的活性F組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.01)AChE活性較CNTL組明顯升高,F+LYCO組大鼠海馬(P0.01)及皮層(P0.05)AChE活性表達(dá)較F組降低,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.01)AChE活性仍低于CNTL組,CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。F組大鼠海馬(P0.01)及皮層(P0.01)ACh含量較CNTL組明顯降低,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)ACh含量表達(dá)較F組升高,F+LYCO組大鼠海馬(P0.05)及皮層(P0.05)ACh含量仍低于CNTL組,CNTL組和LYCO組之間無明顯差異。研究結(jié)論1.果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)建立的外周胰島素抵抗大鼠模型重復(fù)性及穩(wěn)定性好,是胰島素抵抗機(jī)制及干預(yù)研究較為理想的模型。番茄紅素可以改善外周胰島素抵抗。2.中樞胰島素信號通路受損存在于胰島素抵抗模型,番茄紅素可以影響中樞胰島素信號通路,改善中樞胰島素抵抗。增強(qiáng)IR,IGF-1R,PI3K及PKB/AKT等指標(biāo)表達(dá)可能是番茄紅素保護(hù)胰島素抵抗大鼠腦組織損傷的重要分子生物學(xué)機(jī)制之一。3.胰島素抵抗大鼠認(rèn)知功能下降,番茄紅素治療后可以部分逆轉(zhuǎn)上述改變,提高膽堿能系統(tǒng)活性,改善了認(rèn)知功能障礙。4.神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂、細(xì)胞核濃縮現(xiàn)象,是胰島素抵抗大鼠海馬與皮層的病理表現(xiàn),而番茄紅素可以顯著的減輕改善上述病理改變,提示了其明顯神經(jīng)保護(hù)作用。5.胰島素抵抗大鼠海馬與皮層中AGEs表達(dá)增加,與之伴隨的RAGE mRNA表達(dá)水平增加。番茄紅素治療后海馬與皮層中AGEs表達(dá)減少,RAGE mRNA水平顯著下降。6.胰島素抵抗大鼠海馬與皮層中氧化產(chǎn)物含量明顯增高,而抗氧化系統(tǒng)活性降低。給予番茄紅素治療后氧化產(chǎn)物含量明顯降低,抗氧化作用顯著升高,表明了番茄紅素的抗氧化作用。7.胰島素抵抗大鼠海馬與皮層中NF-κB、TNF-α和IL-1β顯著升高,番茄紅素治療后可以顯著降低各炎癥因子水平,抑制炎癥反應(yīng)。8.胰島素抵抗大鼠海馬與皮層中PPARγ表達(dá)下降,提示PPARγ可能是胰島素抵抗腦組織損傷及AD的有效治療靶點(diǎn)。番茄紅素治療后可以顯著升高PPARγ表達(dá)水平�？傊�,番茄紅素具有多效性的“霰彈”特點(diǎn),或可作為預(yù)防和治療AD等中樞神經(jīng)退行性疾病的藥物。研究意義與本課題組以往進(jìn)行的有關(guān)胰島素抵抗的研究相比,該實(shí)驗(yàn)有助于進(jìn)一步了解胰島素抵抗對中樞胰島素信號通路的影響,進(jìn)而從AGEs/RAGE系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、PPARγ改變及膽堿能系統(tǒng)活性等幾方面,探索胰島素抵抗大鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制,明確其與AD的相關(guān)性,為AD等神經(jīng)退行疾病的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。同時(shí)充分研究番茄紅素多效性特點(diǎn),為番茄紅素臨床預(yù)防和治療記憶減退提供了理論依據(jù)和現(xiàn)實(shí)價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：番茄紅素 胰島素抵抗 氧化損傷 神經(jīng)炎癥反應(yīng) 認(rèn)知障礙
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要6-15
• 英文摘要15-27
• 符號說明27-29
• 前言29-32
• 第一部分 胰島素抵抗大鼠中樞胰島素信號通路改變以及番茄紅素的干預(yù)作用32-47
• 材料與方法32-40
• 結(jié)果40-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44
• 附圖表44-47
• 第二部分 番茄紅素對胰島素抵抗大鼠腦組織損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究47-84
• 材料與方法47-66
• 結(jié)果66-69
• 討論69-75
• 結(jié)論75-76
• 附圖表76-84
• 參考文獻(xiàn)84-94
• 綜述94-104
• 參考文獻(xiàn)99-104
• 致謝104-105
• 攻讀博士學(xué)位研究生期間的學(xué)術(shù)成果105-106
• 外文論文Ⅰ106-134
• 外文論文Ⅱ134-163
• 附件163

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李焱;;中樞胰島素抵抗與阿爾茨海默病發(fā)病關(guān)系的認(rèn)識[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2009年03期

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本文編號：1044286