本文關(guān)鍵詞：DHHC蛋白家族成員（ZDHHC16、ZDHHC17）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究報(bào)道證實(shí),細(xì)胞內(nèi)的前體蛋白在翻譯裝配完成后,需要進(jìn)行一系列的修飾才能成為具備生物學(xué)活性的成熟蛋白,執(zhí)行生命活動功能。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要方式包括：泛素化修飾、磷酸化修飾、糖基化修飾和脂質(zhì)化修飾等。其中,脂質(zhì)化修飾對于蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸,分選以及功能的完成至關(guān)重要。通過脂質(zhì)化修飾后的成熟蛋白疏水性增高,與質(zhì)膜系統(tǒng)的脂質(zhì)雙分子層的融合性增強(qiáng),促進(jìn)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位和生命活動的執(zhí)行。目前已知的脂質(zhì)化修飾方式約有五種,蛋白的棕櫚�；揎検亲罱鼛资陝倓偘l(fā)現(xiàn)的一種重要的脂質(zhì)化修飾方式。棕櫚�；揎椀倪^程是指將16碳的飽和脂肪酸-棕櫚酸,通過特定的化學(xué)鍵連接到被修飾蛋白特定的半胱氨酸位點(diǎn)上。目前從酵母到哺乳動物中篩選得到的可被棕櫚酰化修飾的蛋白已達(dá)上百種。目前,最為常見的棕櫚�；揎楊愋褪荢-型,其主要通過硫脂鍵連接棕櫚酸和被修飾蛋白的半胱氨酸位點(diǎn)。與其他四種脂質(zhì)化修飾方式不同,棕櫚�；揎椀倪^程具有動態(tài)可逆性,可通過棕櫚�；プ貦磅；^程,動態(tài)的調(diào)節(jié)被修飾蛋白的活性,從而調(diào)控被修飾蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、靶向融合、下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等,繼而影響細(xì)胞的生命活動。雖然蛋白棕櫚�；揎椩谒氖嗄昵耙驯话l(fā)現(xiàn),然而最近十幾年棕櫚�；揎椕傅陌l(fā)現(xiàn),才使得對于該種修飾方式和被修飾蛋白的研究取得了突破性的進(jìn)展。最初,一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)來自于對酵母的遺傳分析,人們在釀酒酵母中首次發(fā)現(xiàn)了包括Erf2和Akr1在內(nèi)的八種基因編碼的與棕櫚�；揎椨嘘P(guān)的蛋白,并且提出了棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(Palmitoyltransferases, PATs)家族的存在,這一類蛋白的結(jié)構(gòu)具有共同的特征,都含有特征性的鋅指樣(Zinc finger)-DHHC (Aspartate-histidine-histidine-cysteine)-CRD (Cysteine rich domain)結(jié)構(gòu)域,因此這類蛋白又被稱為DHHC蛋白家族,該家族的大多數(shù)成員具有棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性。2004年,Bredt研究小組完成了人類與小鼠基因組23種DHHC蛋白基因的克隆和鑒定,與此同時(shí),最近發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)研究和影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,加速了人們對這類蛋白功能的認(rèn)識。近年來研究工作表明,棕櫚�；揎椫饕l(fā)生在神經(jīng)蛋白,隨著對DHHC蛋白-底物研究的日益深入,該家族成員的功能越來越多的被揭示出來。目前認(rèn)為,DHHC蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、生理活動以及某些神經(jīng)、精神類疾病的發(fā)生密切相關(guān)。首先,在神經(jīng)元的各種特化結(jié)構(gòu)如軸突,樹突等形成和生長的過程中,多種關(guān)鍵蛋白可被棕櫚酰化修飾。如神經(jīng)細(xì)胞粘附分子140 (neural cell adhesion molecule 140,NCAM140)和NCAM180的棕櫚�；揎椨欣谄湓谏L錐細(xì)胞膜的脂筏上定位,這一過程對于調(diào)控神經(jīng)元軸突的生長是必不可少的,研究表明,ZDHHC7和ZDHHC3均表現(xiàn)出對NCAM的棕櫚�；揎椈钚�。其次,在神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育過程中,DHHC家族成員也發(fā)揮著重要的作用。參與神經(jīng)干細(xì)胞的生成,自我更新及命運(yùn)決定過程的多條信號通路中的關(guān)鍵分子均可被棕櫚�；揎�,如WNT3a, SHH (Sonic hedgehog, SHH)等。最新的研究證實(shí),flotillin-2可被ZDHHC5棕櫚�；揎�,繼而影響神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化。另外,DHHC蛋白還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢突觸遞質(zhì)的釋放,從而調(diào)控突觸的功能。在神經(jīng)突觸的前后膜上富含可被棕櫚�；揎椀牡鞍�,如突觸相關(guān)蛋白25 (Synaptosome associated protein-25, SNAP-25),突觸后致密蛋白95(Postsynaptic density protein 95)等,其棕櫚�；降母淖儗⒂绊戇@些突觸蛋白在前后膜的定位。目前已證實(shí)ZDHHC2, ZDHHC3, ZDHHC15, ZDHHC17均可介導(dǎo)上述蛋白的棕櫚酰化修飾,與上述蛋白在胞質(zhì)內(nèi)的分選,運(yùn)輸和突觸前后膜上的靶向聚集密切相關(guān)。同時(shí),近年來的研究工作也證實(shí),DHHC蛋白成員可以介導(dǎo)突觸前后膜上多種離子通道亞基的棕櫚�；揎�,動態(tài)的調(diào)控離子通道的活性,調(diào)節(jié)神經(jīng)信號的傳導(dǎo)。最為重要的是,對于哺乳動物的基因遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn),該家族成員與多種神經(jīng)退行性病變和與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)精神類疾病有關(guān),如ZDHHC8的缺失可能誘發(fā)精神分裂癥；對伴X連鎖智力發(fā)育遲滯的一個(gè)家系進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析證實(shí)ZDHHC15的突變?nèi)笔?dǎo)致該疾病的發(fā)生；ZDHHC17與Huntington舞蹈癥的發(fā)病有關(guān)；ZDHHC12參與調(diào)節(jié)APP的代謝,暗示ZDHHC12可能與Alzheimer'sdisease的發(fā)生密切相關(guān)。這些研究結(jié)果表明DHHC蛋白家族成員在神經(jīng)系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)的建立以及功能的完成過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用,故而深入的研究這一類蛋白的功能不僅具有深刻的科學(xué)價(jià)值還具有很大的臨床指導(dǎo)意義。然而目前對這個(gè)家族蛋白功能的研究大多停留在體外水平,體內(nèi)研究尚且處在起步階段。雖然目前已經(jīng)建立了ZDHHC5,8,17基因敲除小鼠模型,但其在體內(nèi)的作用機(jī)制尚不明確。同時(shí),小鼠的發(fā)育模式也不利于觀察棕櫚�；饔迷谂咛グl(fā)育尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用。而模式動物斑馬魚,發(fā)育迅速,遺傳背景清晰,并具有完全透明的身體,便于觀察和實(shí)驗(yàn)操作,因此被廣泛的應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究。本研究選取模式動物斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對象,利用反向遺傳學(xué)手段,研究DHHC家族成員在胚胎神經(jīng)發(fā)育中的作用及分子機(jī)制。第一部分ZDHHC16在神經(jīng)干細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制研究背景介紹ZDHHC16 (zinc finger DHHC-type containing 16)是哺乳動物23種DHHC蛋白中的第16號成員。該基因編碼的氨基酸序列高度保守。分析斑馬魚的zdhhcl6基因發(fā)現(xiàn),基因全1749bp,編碼一個(gè)由387個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。與其他成員相比,目前關(guān)于該基因的研究報(bào)道還比較少,且均停留于體外水平。研究表明,ZDHHC16可以激活c-Abl,參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡程序。但是,ZDHHC16在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的功能目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此,實(shí)驗(yàn)通過胚胎整封原位雜交(Whole-mount in situ hybridization, WISH)、免疫組化、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)等方法研究抑制ZDHHC16表達(dá)后的胚胎表型,探討ZDHHC16在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能,明確ZDHHC16對神經(jīng)干細(xì)胞生命活動的調(diào)控作用,并深入研究ZDHHC16的棕櫚�；揎椈钚詫ι窠�(jīng)干細(xì)胞發(fā)育信號分子的作用。研究內(nèi)容首先,為了了解ZDHHC16在斑馬魚胚胎的時(shí)空表達(dá)模式,本研究設(shè)計(jì)合成了zdhhc16特異性引物和地高辛標(biāo)記的RNA探針,利用RT-PCR技術(shù)和WISH技術(shù),檢測zdhhc16在斑馬魚胚胎發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)以及分布情況。結(jié)果表明,zdhhc16為母源性表達(dá),且在神經(jīng)板形成階段,表達(dá)水平顯著增高。同時(shí),zdhhc16集中表達(dá)于斑馬魚胚胎神經(jīng)板的最前端,這一結(jié)果暗示該基因可能參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)特別是前腦的發(fā)育過程。為了研究ZDHHC16對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響,本研究利用反向遺傳學(xué)手段,設(shè)計(jì)合成針對zdhhc16的Morpholino (MO),在斑馬魚胚胎發(fā)育至1-2細(xì)胞期時(shí)利用顯微注射技術(shù)注入胚胎,觀察表型。結(jié)果顯示,與對照組相比,抑制ZDHHC16表達(dá)后,在胚胎發(fā)育至10hpf (Hours post fertilization)時(shí),神經(jīng)板前端表現(xiàn)出缺陷,至24hpf時(shí)胚胎呈現(xiàn)出端腦體積縮小甚至缺失的表型。48hpf胚胎石蠟切片HE染色結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)果。為了進(jìn)一步揭示ZDHHC16對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,尤其是明確其在端腦發(fā)育中的作用,本研究利用原位雜交技術(shù),檢測多個(gè)標(biāo)志基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,抑制ZDHHC16表達(dá)后,24hpf胚胎中后腦的標(biāo)記基因otx2 (Orthodenticle homeobox 2), pax2a (Paired box 2a), krox20 (Early growth response 2)表達(dá)均正常,而端腦標(biāo)記基因foxg1 (Forkhead box G1), emx2 (Empty spiracles homeobox 2), dlx2 (Distal-less homeobox 2)的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的減弱,免疫組化檢測神經(jīng)元標(biāo)記基因acetylated a-tubulin的表達(dá)也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。上述結(jié)果暗示ZDHHC16在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中參與端腦發(fā)育的調(diào)控。由于抑制ZDHHC16后胚胎在神經(jīng)發(fā)育早期出現(xiàn)缺陷,因此我們利用原位雜交技術(shù),在神經(jīng)板形成階段(75%下包期)檢測神經(jīng)標(biāo)記基因sox3 (Sex determining region Y-box 3)和rx3 (Retinal homeobox gene 3)的表達(dá)。結(jié)果顯示,與對照組相比,其在神經(jīng)板前端的表達(dá)減弱,提示ZDHHC16可能參與了胚胎端腦神經(jīng)干細(xì)胞生命活動的調(diào)控。接下來,分別在體內(nèi)水平和體外水平,研究ZDHHC16對端腦神經(jīng)干細(xì)胞的作用。利用原位雜交和RT-PCR技術(shù)檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記基因sox2的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)抑制ZDHHC16后sox2 (Sex determining region Y-box 2)的表達(dá)減弱,mRNA水平降低,提示神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量減少。接著,利用BrdU摻入實(shí)驗(yàn),RT-PCR和原位雜交檢測增殖相關(guān)基因-pcna (Proliferating cell nuclear antigen)和mcm5 (Minichromosome maintenance complex component 5),切片TUNEL染色技術(shù),分別檢測端腦處神經(jīng)干細(xì)胞的增殖水平和凋亡情況。結(jié)果顯示,抑制ZDHHC16的表達(dá)后,凋亡的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量沒有明顯的變化,而端腦處神經(jīng)干細(xì)胞的增殖水平減弱。同時(shí),在體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)干細(xì)胞中得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,與體內(nèi)的結(jié)果一致,也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。最后,為了探索ZDHHC16調(diào)控端腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖的機(jī)制。本研究利用RT-PCR技術(shù)檢測參與神經(jīng)干細(xì)胞增殖的多條信號通路下游關(guān)鍵因子的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,抑制ZDHHC16的表達(dá),FGF通路下游的轉(zhuǎn)錄因子pea (ets variant 4), erm (ets variant 5)的mRNA表達(dá)水平顯著下降,接著,通過Western blot檢測FGF通路關(guān)鍵效應(yīng)蛋白ERK的磷酸化水平,結(jié)果也出現(xiàn)了顯著的下調(diào)。此外,利用Western blot技術(shù)檢測FGF通路中配體和受體蛋白的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)抑制ZDHHC16并不會影響上述基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平,暗示ZDHHC16通過影響ERK上游激酶的活性發(fā)揮作用。同時(shí),本研究通過體外合成ZDHHC16ADHHC表達(dá)載體,與zdhhc16 MO共同注射斑馬魚胚胎進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ZDHHC16ADHHC并不能像野生型ZDHHC16一樣挽救注射表型,上調(diào)ERK的磷酸化水平,因此我們推測ZDHHC16通過其棕櫚�；揎椬饔�,影響ERK上游的MEK蛋白激酶的活性,調(diào)節(jié)ERK的磷酸化水平,進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控端腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖的功能。結(jié)論神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新的特性,其數(shù)量的維持和命運(yùn)的決定依賴于一系列復(fù)雜的內(nèi)外源性因子和信號分子為其提供精確穩(wěn)定的環(huán)境。神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等事件正確有序的進(jìn)行對于神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育以及功能的完成具有至關(guān)重要的作用。本研究以斑馬魚為模型,探索ZDHHC16對端腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中,ZDHHC16通過其棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性,調(diào)節(jié)FGF/ERK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),繼而促進(jìn)端腦神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。本研究加深了DHHC蛋白家族及蛋白的棕櫚�；揎椬饔迷谏窠�(jīng)發(fā)育中的功能的理解,同時(shí)也為神經(jīng)管發(fā)育畸形的研究特別是對端腦缺陷的研究和臨床治療提供了新線索。第二部分ZDHHC17在神經(jīng)元軸突生長過程中的作用及機(jī)制研究背景介紹ZDHHC17 (zinc finger DHHC-type containing 17)是哺乳動物中23種DHHC蛋白中的第17號成員,該基因編碼含633個(gè)氨基酸的蛋白,其蛋白結(jié)構(gòu)包括N-端的6-8個(gè)錨蛋白重復(fù)序列(Ankyrinrepeats, ANK)以及五個(gè)跨膜螺旋,其特征性的DHHC結(jié)構(gòu)域位于靠近第四個(gè)跨膜螺旋的位置。研究證實(shí),ZDHHC17在體內(nèi)主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng),暗示該蛋白的功能可能特異性的與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生命活動有關(guān)。近年來對于ZDHHC17功能的研究主要集中在與某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的關(guān)系。目前建立的ZDHHC17基因敲除小鼠模型表現(xiàn)出與人類的亨廷頓舞蹈癥類似的表型,提示該基因可能與亨廷頓舞蹈癥的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí),許多參與調(diào)控神經(jīng)信號傳遞的關(guān)鍵蛋白,如SNAP25、PSD95等均可被ZDHHC17棕櫚�；揎�。另外,研究表明,ZDHHC17可以修飾Mg2+、Ca2+等離子通道,調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。最新的研究發(fā)現(xiàn),ZDHHC17可以活化JNK (c-Jun N-terminus kinase, JNK)信號通路,參與調(diào)節(jié)下游信號通路的傳導(dǎo)。然而,關(guān)于ZDHHC17在神經(jīng)發(fā)育中的作用及分子機(jī)制,目前尚無人涉及。因此本研究選取斑馬魚為動物模型,利用顯微注射MO的方法,建立ZDHHC17-knockdown胚胎模型,同時(shí)通過建立原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的細(xì)胞模型和神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor, NGF)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元的體外模型,利用RNAi技術(shù),共同探討ZDHHC17在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用及分子機(jī)制。研究內(nèi)容首先,為了研究ZDHHC17在斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育中的作用,本部分研究利用RT-PCR技術(shù)和WISH技術(shù),檢測zdhhc17 mRNA在斑馬魚胚胎中的時(shí)空表達(dá)譜。結(jié)果顯示,zdhhc17集中表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng),且從尾芽期開始,表達(dá)水平顯著增高。接著,我們選取1-2細(xì)胞期胚胎,顯微注射zdhhc17 MO抑制ZDHHC17蛋白的翻譯,構(gòu)建ZDHHC17-knockdown胚胎模型,同時(shí)注射小鼠zdhhc17 mRNA構(gòu)建ZDHHC17-overexpression模型,并觀察表型。結(jié)果顯示,抑制ZDHHC17表達(dá)的胚胎外觀與注射Con MO的胚胎沒有差別。但是Touch-response test結(jié)果顯示,抑制ZDHHC17表達(dá)后,發(fā)育至3dpf (Days post fertilization)的胚胎,運(yùn)動能力明顯降低,表現(xiàn)為受刺激后游動速率減慢,游動距離縮短。利用免疫熒光染色技術(shù)檢測神經(jīng)元標(biāo)記基因Znp-1,結(jié)果顯示,胚胎發(fā)育至28hpf,抑制組胚胎的運(yùn)動神經(jīng)元軸突的生長受限,而過表達(dá)組胚胎的運(yùn)動神經(jīng)元軸突則呈現(xiàn)生長過度的傾向。然而,對于22hpf胚胎的Islet1 (ISL LIM homeobox 1)的染色結(jié)果表明,各組間神經(jīng)元生成的數(shù)量并沒有明顯的差異,提示該蛋白的功能可能與神經(jīng)元軸突的生成密切相關(guān),并不影響神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證在體內(nèi)模型中觀察到的結(jié)果,本研究又建立了原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元模型和NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞定向分化的體外模型,通過RNAi技術(shù)抑制ZDHHC17的表達(dá),觀察神經(jīng)元分支生長情況和神經(jīng)元生成的數(shù)量,得到的結(jié)果均與體內(nèi)結(jié)果一致。接下來,為了探索ZDHHC17調(diào)控神經(jīng)元軸突生長的作用機(jī)制,本研究以NGF誘導(dǎo)的定向分化為神經(jīng)元的PC12細(xì)胞為模型,利用Western blot技術(shù)檢測參與調(diào)控神經(jīng)元分化的重要信號通路-絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的關(guān)鍵因子,包括p-ERK (phosphorylated extracellular regulated MAP kinase, p-ERK), p-JNK, p-p38,結(jié)果表明,在抑制ZDHHC17的表達(dá)后,ERK的磷酸化水平顯著下降,而p-JNK和p-p38的表達(dá)則無明顯變化。因此,本研究繼續(xù)探索ZDHHC17促進(jìn)ERK磷酸化的機(jī)制。分析ZDHHC17的蛋白結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其不含有激酶結(jié)構(gòu)域,因此我們推測ZDHHC17通過影響ERK上游其他激酶的活性調(diào)控ERK磷酸化。我們構(gòu)建帶有GFP標(biāo)簽的ZDHHC17表達(dá)載體,利用免疫共沉淀技術(shù),檢測ZDHHC17與ERK上游的激酶TrkA (Tyrosine kinase A, TrkA)和cAMP依賴型蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase A, PKA)的結(jié)合情況。結(jié)果表明,ZDHHC17僅可以與TrkA結(jié)合。同時(shí)免疫熒光檢測結(jié)果表明,抑制ZDHHC17表達(dá)后,表達(dá)TrkA陽性的運(yùn)輸囊泡聚集在細(xì)胞核的核周,其在胞質(zhì)內(nèi)的運(yùn)輸受到抑制,提示ZDHHC17通過促進(jìn)TrkA在胞質(zhì)內(nèi)的運(yùn)輸,調(diào)控下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前的研究認(rèn)為TrkA在胞質(zhì)內(nèi)通常沿著微管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)運(yùn)輸,并且可以反作用于微管蛋白(tubulin)、調(diào)節(jié)微管蛋白的動態(tài)平衡。因此我們分別在體內(nèi)體外,利用免疫共沉淀技術(shù)檢測tubulin蛋白與TrkA蛋白的相互作用。結(jié)果表明,抑制ZDHHC17表達(dá)以后,TrkA和tubulin的結(jié)合能力減弱,而過表達(dá)ZDHHC17可以促進(jìn)TrkA和tubulin的相互作用。證明ZDHHC17是通過調(diào)節(jié)TrkA-tubulin復(fù)合物的形成,影響TrkA激酶在胞質(zhì)內(nèi)的運(yùn)輸,導(dǎo)致下游p-ERK表達(dá)水平的變化,繼而調(diào)控神經(jīng)元軸突的生長。最后,為了進(jìn)一步深入研究ZDHHC17促進(jìn)TrkA-tubulin復(fù)合物形成的機(jī)制,我們分析ZDHHC17的蛋白結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其含有可能與蛋白識別粘附作用有關(guān)的錨蛋白重復(fù)序列,因此,我們構(gòu)建缺失型ZDHHC17蛋白表達(dá)載體(ZDHHC17△ANK)轉(zhuǎn)染NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型,利用Westernblot檢測ERK的磷酸化水平,結(jié)果顯示,過表達(dá)ZDHHC17△ANK并不能如過表達(dá)野生型ZDHHC17一樣,顯著的提高ERK1/2的磷酸化水平,提示我們ZDHHC17調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突生長并不依賴于其棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性,而其錨蛋白結(jié)構(gòu)域參與調(diào)控TrkA-tubulin復(fù)合物的形成。結(jié)論在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中,神經(jīng)元軸突的生成對于突觸的形成,神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)系統(tǒng)功能的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要。神經(jīng)元軸突的正常生長依賴于適宜的生長環(huán)境和一系列內(nèi)源性的神經(jīng)相關(guān)蛋白的共同作用。本研究證實(shí),在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中,ZDHHC17通過促進(jìn)TrkA-tubulin復(fù)合物的形成,影響下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突的生長。與之前的大多數(shù)研究不同,本研究結(jié)果表明,ZDHHC17蛋白的錨蛋白結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)TrkA-tubulin復(fù)合物的形成,而這一過程是不依賴于其棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性的。上述結(jié)果不僅拓展了ZDHHC17在神經(jīng)發(fā)育過程中的作用,深化了其分子調(diào)控機(jī)制,更是為該家族蛋白作用機(jī)制的研究提供了新的視角。
【關(guān)鍵詞】：ZDHHC16 神經(jīng)干細(xì)胞 棕櫚酰化 端腦 FGF/ERK ZDHHC17 軸突生長 ERK1/2 TrkA Tubulin
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R321
【目錄】：

• 中文摘要7-14
• Abstract14-20
• 符號說明20-23
• 前言23-31
• 第一章 ZDHHC16在神經(jīng)干細(xì)胞增殖過程中的作用及機(jī)制的研究31-91
• 背景介紹31
• 第一部分 ZDHHC16在胚胎端腦發(fā)育過程中作用的研究31-70
• 材料和方法31-61
• 結(jié)果61-63
• 討論63-65
• 結(jié)論65
• 附圖65-70
• 第二部分 ZDHHC16對神經(jīng)干細(xì)胞存活影響的研究70-81
• 材料和方法70-75
• 結(jié)果75-76
• 討論76-77
• 結(jié)論77-78
• 附圖78-81
• 第三部分 ZDHHC16調(diào)節(jié)端腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖的機(jī)制研究81-91
• 材料方法81-83
• 結(jié)果83-85
• 討論85-87
• 結(jié)論87-88
• 附圖88-91
• 第二章 ZDHHC17在神經(jīng)元軸突生長過程中的作用及機(jī)制研究91-123
• 背景介紹91
• 第一部分 ZDHHC17在神經(jīng)元生長過程中作用的研究91-109
• 材料和方法91-98
• 結(jié)果98-101
• 討論101-104
• 結(jié)論104
• 附圖104-109
• 第二部分 ZDHHC17調(diào)控神經(jīng)元軸突生長的機(jī)制研究109-123
• 材料和方法109-113
• 結(jié)果113-115
• 討論115-117
• 結(jié)論117-118
• 附圖118-123
• 參考文獻(xiàn)123-133
• 致謝133-134
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄134-135
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表135-136
• 英文論文1136-158
• 英文論文2158-183

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1032981