本文關(guān)鍵詞：小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究

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【摘要】：肌腱是肌肉兩端索狀的致密結(jié)締組織,分別附著在兩塊或兩塊以上不同的骨上便于肌肉附著和固定,其功能是從肌肉傳遞力至骨、支持身體移動(dòng)。由于急性創(chuàng)傷或慢性損傷導(dǎo)致的肌腱損傷是常見(jiàn)疾病,常伴隨疼痛及軀體發(fā)病從而影響生活。由于肌腱缺乏血管和細(xì)胞,所以受傷的肌腱自愈能力極為有限。目前,臨床選擇治療肌腱損傷大多為自體移植和異體移植。自體移植會(huì)對(duì)患者造成二次創(chuàng)傷,而同種異體移植又會(huì)有傳染病原體及免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái),組織工程技術(shù)顯示了對(duì)肌腱再生和修復(fù)的強(qiáng)大潛力。大量的研究方法使用了多種類(lèi)型的細(xì)胞,支架材料對(duì)肌腱進(jìn)行再生和修復(fù),但直到現(xiàn)在還沒(méi)有得到臨床切實(shí)可行的辦法。腱細(xì)胞(Tenocytes)是肌腱的固有細(xì)胞,具有其他種子細(xì)胞無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì),但是,獲得腱細(xì)胞會(huì)對(duì)患者造成二次傷害,而且取得的細(xì)胞數(shù)量少,體外培養(yǎng)腱細(xì)胞短期內(nèi)就會(huì)丟失其表型。真皮成纖維細(xì)胞(Dermal fibroblast)可以通過(guò)皮膚活檢獲得而且適合于體外培養(yǎng),真皮成纖維細(xì)胞能夠與多數(shù)生物材料粘附并增殖,合成豐富的細(xì)胞外基質(zhì),但真皮成纖維細(xì)胞在腱修復(fù)的過(guò)程中易形成瘢痕,影響肌腱的力學(xué)功能,而且受限于患者的年齡。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow-derived Stem Cells)可以通過(guò)微創(chuàng)獲得,體外培養(yǎng)有較強(qiáng)的增殖能力,擁有骨,軟骨,脂肪和肌腱分化的潛力。以往的研究結(jié)果顯示,MSCs可以形成肌腱樣組織并改進(jìn)受傷肌腱的機(jī)械性能。但長(zhǎng)期體內(nèi)移植表明,修復(fù)的肌腱組織經(jīng)常發(fā)生骨化、損害了肌腱的結(jié)構(gòu)并影響功能。胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell)因具有全能性及無(wú)限增殖能力而備受學(xué)者青睞。歐陽(yáng)宏偉等建立了胚胎干細(xì)胞在體外分化為肌腱細(xì)胞、并用于腱再生的方法,其結(jié)果表明,胚胎干細(xì)胞來(lái)源的肌腱細(xì)胞通過(guò)表達(dá)肌腱特異性蛋白,分泌生長(zhǎng)因子從而促進(jìn)腱再生,同時(shí)無(wú)任何畸胎瘤和骨化發(fā)生。然而,使用胚胎干細(xì)胞涉及胚胎的破壞,所以一直受到倫理道德的限制。孤雌干細(xì)胞(parthenogenetic Embryonic Stem Cells)可通過(guò)孤雌囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)獲得,在許多方面具有與ESCs相似的特性。pSCs來(lái)源于化學(xué)或物理方法激活的卵母細(xì)胞,沒(méi)有破壞受精卵,從而避免了倫理道德方面的限制。在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中,孤雌囊胚不能發(fā)育為胎兒(遺傳缺陷影響胎盤(pán)形成),而且HLA單倍型使pSC有較好的組織相容性,可以減少移植后免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn),相比較ESCs具有更大的優(yōu)越性。pSCs可以分化為視網(wǎng)膜色素上皮樣細(xì)胞、肌肉樣和骨樣細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞。據(jù)報(bào)道pSCs分化的心肌細(xì)胞可以明顯改善受損的心肌,更重要的是,pSCs來(lái)源的心肌細(xì)胞在異體移植中表現(xiàn)出免疫耐受,賦予了pSCs廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)方法目前已可以將ESCs向肌腱細(xì)胞定向誘導(dǎo),然而迄今為止沒(méi)有研究利用pSCs向肌腱細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。因此本研究以pSCs作為種子細(xì)胞,通過(guò)擬胚體(EBs)的自主分化、刮取纖維樣細(xì)胞、接種并擴(kuò)增；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定其表型為間充質(zhì)干細(xì)胞(pMSCs),通過(guò)體外成骨、成軟骨及成脂能力進(jìn)一步驗(yàn)證。將pMSCs接種于Flexcell彈力板進(jìn)行力學(xué)加載,誘導(dǎo)pMSCs分化為肌腱細(xì)胞；將pMSCsi(pMSCs加載力學(xué)刺激后)接種于PLGA三維支架材料,進(jìn)行異位移植,在體內(nèi)成功構(gòu)建了肌腱樣組織。新生組織具有天然肌腱的結(jié)構(gòu)特征,表達(dá)膠原合成相關(guān)因子、肌腱修復(fù)相關(guān)因子和肌腱細(xì)胞表型標(biāo)志。1.pSCs的體外培養(yǎng)特征及全能性鑒定將C57BL/6小鼠pSCs及129S4/SvJae小鼠ESCs (J1)體外培養(yǎng)并進(jìn)行全能性鑒定,包括堿性磷酸酶染色,全能性表面抗原SSEA-1和全能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog免疫細(xì)胞化學(xué)染色,WST-1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)與細(xì)胞周期相關(guān)的印記基因；克隆形成實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞形成克隆的能力,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)與細(xì)胞粘附,遷移相關(guān)基因,為其向肌腱細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2. pSCs形成EBs及特征將pSCs接種于低粘附性96孔培養(yǎng)板形成EBs,計(jì)算EBs形成的效率。將5天后形成的EBs包埋于石蠟,行HE及TUNEL染色,觀(guān)察EB的大體及凋亡特征。3.體內(nèi)體外分化全能性鑒定EBs形成5天后,將EBs接種于鋪有明膠的培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)7天、14天、21天、28天,倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)內(nèi),中,外胚層相關(guān)基因表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)pSCs與ESCs自主分化中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因。免疫組織化學(xué)染色確定EBs分化時(shí),中胚層基因是否表達(dá)。皮下注射pSCs和ESCs觀(guān)察體內(nèi)畸胎瘤形成。4.獲得pSCs來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(pMSCs)據(jù)上述實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果,在EBs接種于鋪有明膠的培養(yǎng)板中7天后,使用細(xì)胞刮刮取纖維狀細(xì)胞團(tuán)塊,自然沉降后接種至新的培養(yǎng)板,體外擴(kuò)增。流式細(xì)胞術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)所得到的細(xì)胞系。5.pMSCs向骨,軟骨,脂肪誘導(dǎo)分化使用成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)液,將上述得到的細(xì)胞向骨、軟骨及脂肪細(xì)胞定向分化。對(duì)pMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)后,在不同的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)骨、軟骨及脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因、茜素紅、Von Kossa、番紅O、油紅O染色和免疫組織化學(xué)染色對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。6.機(jī)械拉伸誘導(dǎo)pMSCs向肌腱細(xì)胞方向分化對(duì)pMSCs實(shí)施不同時(shí)間的機(jī)械拉力(頻率：0.1Hz;應(yīng)變力大小：10%形變；拉伸時(shí)間：24小時(shí)和10天),通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、Western-blot及免疫組織化學(xué)檢測(cè)肌腱細(xì)胞標(biāo)志基因的變化。C57/BL6小鼠骨髓MSCs和fibroblast作為對(duì)照組。7.拉力誘導(dǎo)后的細(xì)胞與PLGA的生物可容性將拉力刺激10天后的pMSCs接種三維支架材料PLGA上,通過(guò)DNA提取、激光共聚焦顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀(guān)察細(xì)胞在三維支架上的生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。8.體內(nèi)生成組織工程肌腱將上述支架-細(xì)胞(CM-Dil標(biāo)記)復(fù)合物接種于裸鼠皮下,分別在6周和12周后取出,通過(guò)大體觀(guān)察、組織學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色、特殊染色及激光共聚焦顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡檢測(cè)新生組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法,我們獲得了如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.pSCs具有全能性、克隆形成及增殖能力,隨體外傳代次數(shù)增加全能性保持不變。pSCs堿性磷酸酶染色陽(yáng)性,SSEA-1、Nonog和OCT4表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。體外培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞具有克隆形成的能力,不過(guò)較ESCs少。當(dāng)接種密度為100和250/孔時(shí),pSCs及ESCs形成的克隆分別為14.00 ± 3.08 vs.20.44 ± 4.95 (p= 0.004),38.22 ± 4.43 vs.44.22 ± 4.32 (p= 0.01)。pSCs形成點(diǎn)狀克隆,為典型的"holocolony",而ESCs形成點(diǎn)狀或環(huán)狀克隆,隨細(xì)胞接種密度增加,此現(xiàn)象愈加明顯。與pSCs相比,ESCs顯著高表達(dá)vtn但itgbl表達(dá)并無(wú)差異。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示ESCs表達(dá)Itgbl及Vtn強(qiáng)烈且均勻的分布的分布于整個(gè)細(xì)胞克隆。而pSCs中,Itgbl及Vtn只是零星的分布于細(xì)胞表面。WST-1實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞具有增殖能力,但也較ESCs低。igf2r和p57kiP2表達(dá)并無(wú)差異,igf2在J1細(xì)胞明顯高表達(dá)(3.26±0.4 vs.1.09±0.21,p0.001).2.pSCs體外懸浮培養(yǎng)均可以有效地形成EBs,但形成EBs的能力比ESCs低(21.7%±3.4%vs.35.3%±5.2%)。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EBs形成的過(guò)程中ESCs凋亡細(xì)胞比率較低(8.79%±2.21%vs.9.28%±3.8%),但差異無(wú)顯著性。3.將上述EBs接種至包被有明膠的培養(yǎng)板,不同時(shí)間點(diǎn)收取樣品總RNA。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示伴隨EBs自主分化,pSCs和ESCs均具有向內(nèi)、中、外三胚層分化的能力,經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證明兩種細(xì)胞均具有向中胚層分化的能力。EBs接種至鋪有明膠的培養(yǎng)板,遷移出的細(xì)胞具有多種形態(tài),分別有上皮狀、纖維狀及心肌細(xì)胞�；チ鰧�(shí)驗(yàn)證明pSCs在體內(nèi)也具有向內(nèi)、中、外三胚層分化的能力,形成成熟的骨、軟骨、肌肉、淋巴管、粘液上皮及神經(jīng)節(jié)。4.使用細(xì)胞刮刮取纖維狀細(xì)胞團(tuán)塊,接種后可以體外擴(kuò)增,可獲得形態(tài)較一致纖維狀細(xì)胞(pMSCs)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果證明pMSCs表達(dá)CD29、CD13、CD44、CD73、 CD90.2和CD105。免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)pMSCs表達(dá)中胚層標(biāo)志物Vimentin, Myog, Myosin heavy chain和α-Actin。與eMSCs的特征基本一致。5.獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞(pMSCs及eMSCs)均具有向骨,軟骨,脂肪分化的能力。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示成骨標(biāo)志基因alp, ibsp, bglapl, opn和runx2表達(dá)明顯上調(diào)。茜素紅和Von Kossa染色陽(yáng)性,證明pMSCs及eMSCs均具有成骨能力。實(shí)時(shí)定量PCR顯示col2al及aggrecan在pMSCs及eMSCs誘導(dǎo)21天后均出現(xiàn)明顯地上調(diào),番紅O及免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示COL2al及Aggrecan陽(yáng)性,證明pMSCs及eMSCs均具有成軟骨能力。實(shí)時(shí)定量PCR顯示fabp4及c/ebp在pMSCs及eMSCs誘導(dǎo)28天后均出現(xiàn)明顯地上調(diào),油紅O染色陽(yáng)性,表明pMSCs及eMSCs具有成脂肪能力。6.機(jī)械拉伸可以誘導(dǎo)pMSCs向肌腱細(xì)胞方向分化。細(xì)胞持續(xù)加載應(yīng)力24小時(shí)或者間隔加力10天(16h/d)均可以使肌腱特異性基因(tnc、collal、col3al、tnmd、eya2、ephap4)表達(dá)上調(diào)。col1a1:3a1膠原比率上升。加載力學(xué)刺激后,細(xì)胞排列具有方向性,免疫細(xì)胞化學(xué)顯示Col1a1、Col3a1、Col5a1、Hsp47、TNMD、EYA2、TNC、Bmp2及Bmp13均陽(yáng)性表達(dá)。7.激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀(guān)察結(jié)果顯示,PLGA與應(yīng)力加載后的細(xì)胞具有良好的組織相容性。細(xì)胞在3D支架可以增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)。8.異位移植后取出細(xì)胞-材料復(fù)合物,樣本表面光滑,呈半透明狀。組織學(xué)染色結(jié)果表明新生組織細(xì)胞排列整齊,且延長(zhǎng)軸分布,大體觀(guān)察顯示6周及12周組織Collal, Col3a1, Col5a1, Hsp47, TNMD, EYA2, TNC, Bmp2及Bmp13均陽(yáng)性表達(dá)。移植12周后,新生組織膠原纖維沿長(zhǎng)軸密集排列且呈典型的波浪狀。激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察CM-Dil標(biāo)記陽(yáng)性,表明新生組織由移植后的細(xì)胞構(gòu)成。結(jié)論孤雌胚胎干細(xì)胞可以分化為MSC,經(jīng)定向誘導(dǎo)分化后可分化為肌腱樣細(xì)胞,用于組織工程肌腱再造。創(chuàng)新點(diǎn)：1,對(duì)小鼠pSCs體外懸浮培養(yǎng)是否形成擬胚體、形成擬胚體的效率進(jìn)行研究,有助于研究pSCs的后續(xù)分化。TUNEL染色證實(shí)小鼠pSCs在缺少父系基因印記時(shí),也可以發(fā)生凋亡。2,通過(guò)擬胚體自主分化,證明pSCs與ESCs均表現(xiàn)出上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。3,通過(guò)擬胚體自主分化,得到較純的小鼠pSCs來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞。4,將pSCs來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肌腱樣細(xì)胞,并用于體內(nèi)肌腱樣組織再生。
【關(guān)鍵詞】：組織工程 孤雌胚胎干細(xì)胞 分化 肌腱細(xì)胞 拉力
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R686.1
【目錄】：

• 中文摘要3-8
• Abstract8-19
• 附件19-27
• 第一章 緒論27-39
• 1. 肌腱的生理組成27
• 2. 肌腱的功能27-28
• 3. 肌腱血管化28
• 4. 肌腱內(nèi)的細(xì)胞28
• 5. 肌腱的ECM(細(xì)胞外基質(zhì))及形成28-30
• 6. 與其他組織相互作用30
• 7. 肌腱的損傷與修復(fù)30-31
• 8. 肌腱損傷后手術(shù)和重建策略31-32
• 9. 肌腱組織工程中的生物材料32-35
• 9.1 支架材料32
• 9.2 組織工程支架材料的類(lèi)型32-33
• 9.3 合成支架材料33
• 9.4 天然支架33-34
• 9.5 復(fù)合支架34-35
• 10. 肌腱組織工程中的細(xì)胞類(lèi)型35-38
• 10.1 孤雌胚胎干細(xì)胞(pSCs)36-37
• 10.2 pSCs作為組織工程種子細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)37-38
• 11 本論文研究的主要內(nèi)容及意義38-39
• 第二章 pSCs的體外培養(yǎng)及全能性鑒定39-53
• 1 材料39-41
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料39
• 1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑39-41
• 2 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 2.1 制備滋養(yǎng)層41
• 2.2 pSCs和ESCs體外培養(yǎng)41-42
• 2.3 pSCs和ESCs傳代42
• 2.4 pSCs和ESCs的凍存42
• 2.5 試劑的配制42
• 2.6 pSCs和ESCs的生物特征42-43
• 2.6.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)全能性標(biāo)記物42-43
• 2.6.2 堿性磷酸酶染色43
• 2.6.3 透射電鏡觀(guān)察43
• 2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)43
• 2.8 WST-1實(shí)驗(yàn)43
• 2.9 實(shí)時(shí)定量PCR43-45
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-51
• 3.1 pSCs和ESCs的形態(tài)學(xué)觀(guān)察45-46
• 3.2 堿性磷酸酶(ALP)染色46
• 3.3 透射電鏡觀(guān)察46-47
• 3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)全能性標(biāo)記物47-48
• 3.5 WST-1實(shí)驗(yàn)48-49
• 3.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)49-51
• 4. 討論51-52
• 5. 小結(jié)52-53
• 第三章 pSCs形成EBs的效率與凋亡53-58
• 1 材料53-54
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料53
• 1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑53-54
• 2 實(shí)驗(yàn)方法54-55
• 2.1 EBs的形成54
• 2.2 EBs石蠟包埋54
• 2.3 H&E染色54-55
• 2.4 TUNEL實(shí)驗(yàn)55
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-56
• 3.1 pSCs和ESCs的EBs形成效率55
• 3.2 pSCs和ESCs形成EBs的凋亡情況55-56
• 4 討論56-57
• 5 小結(jié)57-58
• 第四章 pSCs體外與體內(nèi)分化58-71
• 1 材料58-61
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料58
• 1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑58-61
• 2 實(shí)驗(yàn)方法61-62
• 2.1 接種EBs61
• 2.2 觀(guān)察EBs的自主分化61
• 2.3 實(shí)時(shí)定量PCR61
• 2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及中胚層標(biāo)記物61-62
• 2.5 畸胎瘤實(shí)驗(yàn)62
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-69
• 3.1 鏡下觀(guān)察EBs的自主分化62-63
• 3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ESCs和pSCs向內(nèi),中,外胚層分化63-65
• 3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)EMT和中胚層相關(guān)因子65-67
• 3.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)EMT67-68
• 3.5 畸胎瘤實(shí)驗(yàn)68-69
• 4 討論69-70
• 5 小結(jié)70-71
• 第五章 體外獲取pSCs和ESCs的間充質(zhì)細(xì)胞并鑒定71-78
• 1 材料71-73
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料71
• 1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑71-73
• 2 實(shí)驗(yàn)方法73-74
• 2.1 獲取pMSCs及eMSCs73
• 2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原73
• 2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)中胚層標(biāo)記物73-74
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果74-76
• 3.1 獲取pMSCs及eMSCs74
• 3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原74-75
• 3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)中胚層標(biāo)志75-76
• 4. 討論76-77
• 5 小結(jié)77-78
• 第六章 間充質(zhì)細(xì)胞向骨,軟骨及脂肪細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)78-88
• 1 材料78-81
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料78
• 1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑78-81
• 2 實(shí)驗(yàn)方法81-82
• 2.1 成骨誘導(dǎo)81
• 2.2 軟骨誘導(dǎo)81
• 2.3 脂肪誘導(dǎo)81
• 2.4 實(shí)時(shí)定量PCR81
• 2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)成軟骨,成脂標(biāo)記物81-82
• 2.6 特殊染色82
• 2.6.1 茜素紅染色82
• 2.6.3 Von Kossa染色82
• 2.6.4 番紅O染色82
• 2.6.5 油紅O染色82
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果82-86
• 3.1 成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果82-84
• 3.2 成軟骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果84-85
• 3.3 成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)85-86
• 4 討論86-87
• 5 小結(jié)87-88
• 第七章 間充質(zhì)細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)88-101
• 1 材料88-91
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料88
• 1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑88-91
• 2 實(shí)驗(yàn)方法91-93
• 2.1 原代培養(yǎng)91-92
• 2.1.1 肌腱細(xì)胞原代培養(yǎng)91
• 2.1.2 小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)(BMSCs)91
• 2.1.3 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)(Fibroblast)91-92
• 2.3 實(shí)時(shí)定量PCR92
• 2.4 細(xì)胞加載應(yīng)力92
• 2.5 實(shí)時(shí)定量PCR92
• 2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)肌腱細(xì)胞標(biāo)記物92
• 2.7 Western-bolt實(shí)驗(yàn)92-93
• 2.8 WST-1實(shí)驗(yàn)93
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果93-99
• 3.1 原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果93
• 3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)col1al：col3a193-94
• 3.3 持續(xù)24小時(shí)加力實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肌腱細(xì)胞相關(guān)表型94-95
• 3.4 pMSCs 24小時(shí)加力Western-blot檢測(cè)肌腱細(xì)胞相關(guān)表型95-96
• 3.5 間隔加力10天實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肌腱細(xì)胞相關(guān)表型96-97
• 3.6 pMSCs間隔加力10天Western-blot檢測(cè)肌腱細(xì)胞相關(guān)表型97
• 3.7 pMSCs間隔加力10天后免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)肌腱細(xì)胞相關(guān)表型97-99
• 3.8 間隔加力10天后細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)99
• 4 討論99-100
• 5 小結(jié)100-101
• 第八章 應(yīng)力誘導(dǎo)后的pMSCs接種PLGA101-106
• 1 材料101-102
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料101
• 1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑101-102
• 2 實(shí)驗(yàn)方法102-103
• 2.1 CM-Dil染色102
• 2.2 細(xì)胞接種PLGA支架102
• 2.3 評(píng)估細(xì)胞在PLGA上生長(zhǎng)102-103
• 2.3.1 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察102
• 2.3.2 掃描電子顯微鏡觀(guān)察102-103
• 2.3.3 提取DNA103
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果103-105
• 3.1 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察pMSCs~i+PLGA103
• 3.2 電子顯微鏡觀(guān)察pMSCs~i+PLGA103-104
• 3.3 DNA含量測(cè)定104-105
• 4 討論105
• 5. 小結(jié)105-106
• 第九章 pMSCs~i-PLGA體內(nèi)評(píng)估106-113
• 1 材料106-107
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料106
• 1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑106-107
• 2 實(shí)驗(yàn)方法107-108
• 2.1 pMSCs~i+PLGA異位移植裸鼠皮下107
• 2.2 組織學(xué)染色107
• 2.2.1 H&E染色107
• 2.2.2 Masson染色107
• 2.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)107-108
• 2.4 透射電鏡觀(guān)察108
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果108-112
• 3.1 體內(nèi)移植后大體觀(guān)察108-109
• 3.2 體內(nèi)移植6周后組織學(xué)觀(guān)察109
• 3.3 體內(nèi)移植6周后移植物免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果109-110
• 3.4 體內(nèi)移植12周后組織學(xué)觀(guān)察110
• 3.5 體內(nèi)移植12周后移植物免疫組化實(shí)驗(yàn)110-111
• 3.6 透射電鏡觀(guān)察111-112
• 4 討論112
• 5 小結(jié)112-113
• 全文結(jié)論113-114
• 參考文獻(xiàn)114-126
• 攻讀博士期間取得的科研成果126-127
• 致謝127-128
• 作者簡(jiǎn)介128

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Yimei Cong;Jing Ma;Ruizhen Sun;Jianyu Wang;Binghua Xue;Jiaqiang Wang;Bingteng Xie;Juan Wang;Kui Hu;Zhonghua Liu;;Derivation of Putative Porcine Embryonic Germ Cells and Analysis of Their Multi-Lineage Differentiation Potential[J];Journal of Genetics and Genomics;2013年09期

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本文編號(hào)：1035441