本文關鍵詞：MicroRNA-520a-3p對非小細胞肺癌增殖、淋巴轉移影響的機制研究

  更多相關文章： miR-520a-3p 非小細胞肺癌 腫瘤生長 遷移和侵襲

【摘要】：背景與目的肺癌的發(fā)病率和死亡率現(xiàn)均居惡性腫瘤首位,統(tǒng)計學研究發(fā)現(xiàn),近50年來,16%~69%的國家和地區(qū)肺癌發(fā)病率較以往有顯著增加。非小細胞肺癌是肺癌的主要類型之一,近年來發(fā)病率上升尤為明顯。影響非小細胞肺癌生存的主要原因是腫瘤的復發(fā)和轉移,其中淋巴轉移占據(jù)重要地位,且許多非小細胞肺癌淋巴轉移早于血行轉移或是唯一的轉移途徑。研究非小細胞肺癌淋巴轉移的分子機制和信號轉導通路具有重要的理論與臨床意義。雖然國內外學者對非小細胞肺癌淋巴轉移及其細胞信號轉導進行了一些探索,發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴管生成是其中的重要環(huán)節(jié),但目前對非小細胞肺癌淋巴轉移及淋巴管生成的分子機制尚未完全闡明。MicroRNA(mi RNAs)是一類長約18-25個核苷酸的內源性非編碼RNA,可通過與靶基因的mRNA 3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結合來誘導該mRNA的降解或抑制mRNA翻譯過程。近期研究證實,mi RNA也可以作為原癌基因和抑癌基因,在基因調控、細胞凋亡、細胞分化和腫瘤相關的基因損傷修復過程中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種miRNA具有抑制腫瘤的功效。miR-520a來自人miR-520家族,該家族定位于人第19號染色體。目前研究發(fā)現(xiàn),mi R-520a在結腸癌、乳腺癌、髓系白血病和食管鱗癌等多種腫瘤中發(fā)揮重要的抑癌作用,但mi R-520a-3p對非小細胞肺癌的發(fā)生和轉移有何影響,尚不明確。本研究旨在研究miR-520a-3p在非小細胞肺癌的發(fā)生和淋巴轉移中的作用:通過對非小細胞肺癌臨床標本的檢測和分析考察miR-520a-3p對非小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展、惡變和淋巴結轉移之間的關系;通過體外和體內實驗進一步探討miR-520a-3p在調控非小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展和淋巴結轉移的過程中的具體作用及分子機制,通過干預miR-520a-3p的表達水平,采用生物信息學工具和螢光素酶報告基因測定法尋找miR-520a-3p可能的靶分子,并在體內和體外進行驗證和初步的功能分析,以期明確miR-520a-3p在非小細胞肺癌發(fā)病過程中所起的具體作用,為非小細胞肺癌的診斷和治療提供新的方向。方法1.通過收集臨床非小細胞肺癌患者的腫瘤、瘤周及淋巴結標本,根據(jù)不同組織中mir-520-3p的表達水平,以及腫瘤分期、轉移淋巴結數(shù)量、淋巴結轉移部位等,初步分析mir-520a-3p與非小細胞肺癌的發(fā)展、侵襲和轉移的關系。進一步通過檢測腫瘤、瘤周組織中新生淋巴管標志物lyve-1的表達水平與mir-520a-3p表達水平的相關性來分析mir-520a-3p調控非小細胞肺癌淋巴轉移可能機制。2.以非小細胞肺癌a549細胞株為研究對象,使用mir-520a-3p特異性抑制劑反義寡核苷酸和人工合成的mir-520a-3p類似物構建高表達和低表達mir-520a-3p的a549細胞株,并采用mtt細胞增殖實驗、流式細胞技術檢測、transwell細胞爬孔實驗和劃痕實驗等手段,考察mir-520a-3p對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學行為的影響。3.通過構建裸鼠移植瘤模型,對不同mir-520a-3p表達水平的a549細胞移植瘤發(fā)生、發(fā)展過程和成瘤大小、重量及轉移情況進行比較,qrt-pcr和westernblot檢測各組移植瘤樣本中淋巴管內皮標志物lyve-1的表達水平,進一步考察mir-520a-3p對非小細胞肺癌的侵襲和淋巴轉移能力的影響。4.使用熒光素酶報告基因法檢測mir-520a-3p可能的靶分子,并通過qrt-pcr、westernblot、免疫熒光等實驗,進一步驗證mir-520a-3p可能的下游靶分子間的關系,并尋找在mir-520a-3p調控下游靶分子的過程中可能發(fā)揮作用的信號通路分子,探討mir-520a-3p抑制非小細胞肺癌淋巴結轉移的機制。結果1.我們采用qrt-pcr方法檢測了nsclc患者腫瘤、瘤周組織中mir-520a-3p的表達水平,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中mir-520a-3p表達水平明顯低于瘤周組織,而mir-520a-3p與腫瘤淋巴轉移的發(fā)生呈高度相關,即mir-520a-3p表達水平低的患者,發(fā)生淋巴轉移的概率較高,預后較差。mir-520a-3p表達水平與lyve-1負相關。2.采用mtt、流式細胞計數(shù)、劃痕實驗、transwell實驗等檢測mir-520a-3p對非小細胞肺癌a549細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。實驗證實:mir-520a-3p可顯著抑制非小細胞肺癌的增殖、侵襲和遷移能力,而對細胞凋亡有促進作用。3.通過在裸鼠右側臀部皮下注射mir-520a-3p高、中、低表達的非小細胞肺癌a549細胞株,制作裸鼠異位皮下移植瘤模型。構建過程中發(fā)現(xiàn),高表達mir-520a-3p的a549細胞株成瘤過程較緩慢,最終成瘤的體積、重量均較小,而低表達mir-520a-3p的a549細胞株成瘤速度快,最終成瘤的體積、重量均較大。因此mir-520a-3p可能作為一種抑癌因子,抑制非小細胞肺癌的生長。進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-520a-3p表達水平較低的裸鼠移植瘤組織和瘤周組織中淋巴管內皮細胞特異性標志物LYVE-1表達較高,而miR-520a-3p表達水平較高的移植瘤組織和瘤周組織中LYVE-1表達則較低。4.從體內與體外實驗角度考察和分析了miR-520a-3p調控非小細胞肺癌增殖與轉移的可能機制。首先,通過對mi R-520a-3p序列的生物信息學分析選取其可能的靶分子為MAP3K2,使用miR-520a-3p抑制劑處理野生型HEK-293細胞和MAP3K2 3'非編碼區(qū)突變的HEK-293,并檢測二者MAP3K2的表達水平,結果提示,野生型HEK-293細胞中的MAP3K2蛋白表達水平顯著降低,而MAP3K2 3'非編碼區(qū)突變的HEK-293細胞中MAP3K2蛋白表達水平無明顯變化。進一步通過檢測不同mi R-520a-3p表達水平的A549細胞中MAP3K2蛋白的表達水平發(fā)現(xiàn),MAP3K2的表達水平與mi R-520a-3p表達水平負相關,即miR-520a-3p高表達的A549細胞中MAP3K2蛋白表達水平較低,而經miR-520a-3p抑制劑處理后低表達miR-520a-3p的A549細胞中MAP3K2蛋白表達水平較高。在體內實驗中,western blot檢測發(fā)現(xiàn)MAP3K2、caspase 3、bcl-2的表達水平均隨miR-520a-3p表達水平變化。其中MAP3K2、caspase 3與miR-520a-3p呈負相關,而bcl-2與mi R-520a-3p為正相關。結論1.miR-520a-3p在NSCLC患者的腫瘤組織中表達水平低于瘤周組織;腫瘤的惡性程度越高,miR-520a-3p表達水平越低;發(fā)生淋巴轉移病例的腫瘤組織標本中miR-520a-3p表達水平更低;miR-520a-3p與LYVE-1表達水平呈負相關。2.非小細胞肺癌A549細胞中miR-520a-3p表達水平較低;mi R-520a-3p表達水平與A549細胞的增殖、侵襲和遷移能力呈負相關,與A549細胞的凋亡水平呈正相關。3.成功構建裸鼠右側臀部皮下異位移植瘤模型;mi R-520a-3p表達水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈負相關,miR-520a-3p與LYVE-1表達水平呈負相關,與腫瘤的淋巴管生成呈負相關。4.miR-520a-3p表達水平與MAP3K2、caspase 3負相關,與bcl-2呈正相關,即miR-520a-3p可能通過影響MAP3K2、caspase 3、bcl-2的表達而調控非小細胞肺癌的生長、增殖、侵襲和轉移。
【關鍵詞】：miR-520a-3p 非小細胞肺癌 腫瘤生長 遷移和侵襲
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 miR-520a-3p對非小細胞肺癌生物學行為的影響17-32
• 2.1 材料與方法18-23
• 2.2 結果23-28
• 2.3 討論28-31
• 2.4 小結31-32
• 第三章 miR-520a-3p對非小細胞肺癌細胞的生物學影響32-47
• 3.1 材料和方法32-37
• 3.2 結果37-42
• 3.3 討論42-46
• 3.4 小結46-47
• 第四章 miR-520a-3p調控非小細胞肺癌生長、淋巴轉移在體實驗47-66
• 4.1 材料和方法47-56
• 4.2 結果56-61
• 4.3 討論61-64
• 4.4 小結64-66
• 第五章 miR-520a-3p抑制非小細胞肺癌淋巴結轉移的機制研究66-87
• 5.1 材料和方法66-78
• 5.2 結果78-83
• 5.3 討論83-86
• 5.4 小結86-87
• 全文結論87-89
• 參考文獻89-100
• 文獻綜述 miRNA在非小細胞肺癌中的作用100-108
• 參考文獻105-108
• 攻讀博士期間發(fā)表論文情況108-109
• 致謝109

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本文編號：1031137