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MicroRNA-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌增殖、淋巴轉(zhuǎn)移影響的機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間:2017-10-14 12:38

  本文關(guān)鍵詞:MicroRNA-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌增殖、淋巴轉(zhuǎn)移影響的機(jī)制研究


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【摘要】:背景與目的肺癌的發(fā)病率和死亡率現(xiàn)均居惡性腫瘤首位,統(tǒng)計(jì)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),近50年來(lái),16%~69%的國(guó)家和地區(qū)肺癌發(fā)病率較以往有顯著增加。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要類(lèi)型之一,近年來(lái)發(fā)病率上升尤為明顯。影響非小細(xì)胞肺癌生存的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,其中淋巴轉(zhuǎn)移占據(jù)重要地位,且許多非小細(xì)胞肺癌淋巴轉(zhuǎn)移早于血行轉(zhuǎn)移或是唯一的轉(zhuǎn)移途徑。研究非小細(xì)胞肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要的理論與臨床意義。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)非小細(xì)胞肺癌淋巴轉(zhuǎn)移及其細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行了一些探索,發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴管生成是其中的重要環(huán)節(jié),但目前對(duì)非小細(xì)胞肺癌淋巴轉(zhuǎn)移及淋巴管生成的分子機(jī)制尚未完全闡明。MicroRNA(mi RNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)約18-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA,可通過(guò)與靶基因的mRNA 3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)該mRNA的降解或抑制mRNA翻譯過(guò)程。近期研究證實(shí),mi RNA也可以作為原癌基因和抑癌基因,在基因調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和腫瘤相關(guān)的基因損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種miRNA具有抑制腫瘤的功效。miR-520a來(lái)自人miR-520家族,該家族定位于人第19號(hào)染色體。目前研究發(fā)現(xiàn),mi R-520a在結(jié)腸癌、乳腺癌、髓系白血病和食管鱗癌等多種腫瘤中發(fā)揮重要的抑癌作用,但mi R-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有何影響,尚不明確。本研究旨在研究miR-520a-3p在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和淋巴轉(zhuǎn)移中的作用:通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺癌臨床標(biāo)本的檢測(cè)和分析考察miR-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展、惡變和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系;通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討miR-520a-3p在調(diào)控非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過(guò)程中的具體作用及分子機(jī)制,通過(guò)干預(yù)miR-520a-3p的表達(dá)水平,采用生物信息學(xué)工具和螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定法尋找miR-520a-3p可能的靶分子,并在體內(nèi)和體外進(jìn)行驗(yàn)證和初步的功能分析,以期明確miR-520a-3p在非小細(xì)胞肺癌發(fā)病過(guò)程中所起的具體作用,為非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療提供新的方向。方法1.通過(guò)收集臨床非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤、瘤周及淋巴結(jié)標(biāo)本,根據(jù)不同組織中mir-520-3p的表達(dá)水平,以及腫瘤分期、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位等,初步分析mir-520a-3p與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)腫瘤、瘤周組織中新生淋巴管標(biāo)志物lyve-1的表達(dá)水平與mir-520a-3p表達(dá)水平的相關(guān)性來(lái)分析mir-520a-3p調(diào)控非小細(xì)胞肺癌淋巴轉(zhuǎn)移可能機(jī)制。2.以非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞株為研究對(duì)象,使用mir-520a-3p特異性抑制劑反義寡核苷酸和人工合成的mir-520a-3p類(lèi)似物構(gòu)建高表達(dá)和低表達(dá)mir-520a-3p的a549細(xì)胞株,并采用mtt細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)、transwell細(xì)胞爬孔實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)等手段,考察mir-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學(xué)行為的影響。3.通過(guò)構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,對(duì)不同mir-520a-3p表達(dá)水平的a549細(xì)胞移植瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程和成瘤大小、重量及轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行比較,qrt-pcr和westernblot檢測(cè)各組移植瘤樣本中淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物lyve-1的表達(dá)水平,進(jìn)一步考察mir-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌的侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移能力的影響。4.使用熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)mir-520a-3p可能的靶分子,并通過(guò)qrt-pcr、westernblot、免疫熒光等實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證mir-520a-3p可能的下游靶分子間的關(guān)系,并尋找在mir-520a-3p調(diào)控下游靶分子的過(guò)程中可能發(fā)揮作用的信號(hào)通路分子,探討mir-520a-3p抑制非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制。結(jié)果1.我們采用qrt-pcr方法檢測(cè)了nsclc患者腫瘤、瘤周組織中mir-520a-3p的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中mir-520a-3p表達(dá)水平明顯低于瘤周組織,而mir-520a-3p與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈高度相關(guān),即mir-520a-3p表達(dá)水平低的患者,發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的概率較高,預(yù)后較差。mir-520a-3p表達(dá)水平與lyve-1負(fù)相關(guān)。2.采用mtt、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)mir-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)證實(shí):mir-520a-3p可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖、侵襲和遷移能力,而對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。3.通過(guò)在裸鼠右側(cè)臀部皮下注射mir-520a-3p高、中、低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞株,制作裸鼠異位皮下移植瘤模型。構(gòu)建過(guò)程中發(fā)現(xiàn),高表達(dá)mir-520a-3p的a549細(xì)胞株成瘤過(guò)程較緩慢,最終成瘤的體積、重量均較小,而低表達(dá)mir-520a-3p的a549細(xì)胞株成瘤速度快,最終成瘤的體積、重量均較大。因此mir-520a-3p可能作為一種抑癌因子,抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-520a-3p表達(dá)水平較低的裸鼠移植瘤組織和瘤周組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物L(fēng)YVE-1表達(dá)較高,而miR-520a-3p表達(dá)水平較高的移植瘤組織和瘤周組織中LYVE-1表達(dá)則較低。4.從體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)角度考察和分析了miR-520a-3p調(diào)控非小細(xì)胞肺癌增殖與轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。首先,通過(guò)對(duì)mi R-520a-3p序列的生物信息學(xué)分析選取其可能的靶分子為MAP3K2,使用miR-520a-3p抑制劑處理野生型HEK-293細(xì)胞和MAP3K2 3'非編碼區(qū)突變的HEK-293,并檢測(cè)二者M(jìn)AP3K2的表達(dá)水平,結(jié)果提示,野生型HEK-293細(xì)胞中的MAP3K2蛋白表達(dá)水平顯著降低,而MAP3K2 3'非編碼區(qū)突變的HEK-293細(xì)胞中MAP3K2蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)不同mi R-520a-3p表達(dá)水平的A549細(xì)胞中MAP3K2蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),MAP3K2的表達(dá)水平與mi R-520a-3p表達(dá)水平負(fù)相關(guān),即miR-520a-3p高表達(dá)的A549細(xì)胞中MAP3K2蛋白表達(dá)水平較低,而經(jīng)miR-520a-3p抑制劑處理后低表達(dá)miR-520a-3p的A549細(xì)胞中MAP3K2蛋白表達(dá)水平較高。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MAP3K2、caspase 3、bcl-2的表達(dá)水平均隨miR-520a-3p表達(dá)水平變化。其中MAP3K2、caspase 3與miR-520a-3p呈負(fù)相關(guān),而bcl-2與mi R-520a-3p為正相關(guān)。結(jié)論1.miR-520a-3p在NSCLC患者的腫瘤組織中表達(dá)水平低于瘤周組織;腫瘤的惡性程度越高,miR-520a-3p表達(dá)水平越低;發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移病例的腫瘤組織標(biāo)本中miR-520a-3p表達(dá)水平更低;miR-520a-3p與LYVE-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。2.非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miR-520a-3p表達(dá)水平較低;mi R-520a-3p表達(dá)水平與A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力呈負(fù)相關(guān),與A549細(xì)胞的凋亡水平呈正相關(guān)。3.成功構(gòu)建裸鼠右側(cè)臀部皮下異位移植瘤模型;mi R-520a-3p表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈負(fù)相關(guān),miR-520a-3p與LYVE-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),與腫瘤的淋巴管生成呈負(fù)相關(guān)。4.miR-520a-3p表達(dá)水平與MAP3K2、caspase 3負(fù)相關(guān),與bcl-2呈正相關(guān),即miR-520a-3p可能通過(guò)影響MAP3K2、caspase 3、bcl-2的表達(dá)而調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】:miR-520a-3p 非小細(xì)胞肺癌 腫瘤生長(zhǎng) 遷移和侵襲
【學(xué)位授予單位】:第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類(lèi)號(hào)】:R734.2
【目錄】:
  • 縮略語(yǔ)表5-6
  • 英文摘要6-11
  • 中文摘要11-14
  • 第一章 前言14-17
  • 第二章 miR-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為的影響17-32
  • 2.1 材料與方法18-23
  • 2.2 結(jié)果23-28
  • 2.3 討論28-31
  • 2.4 小結(jié)31-32
  • 第三章 miR-520a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)影響32-47
  • 3.1 材料和方法32-37
  • 3.2 結(jié)果37-42
  • 3.3 討論42-46
  • 3.4 小結(jié)46-47
  • 第四章 miR-520a-3p調(diào)控非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)、淋巴轉(zhuǎn)移在體實(shí)驗(yàn)47-66
  • 4.1 材料和方法47-56
  • 4.2 結(jié)果56-61
  • 4.3 討論61-64
  • 4.4 小結(jié)64-66
  • 第五章 miR-520a-3p抑制非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究66-87
  • 5.1 材料和方法66-78
  • 5.2 結(jié)果78-83
  • 5.3 討論83-86
  • 5.4 小結(jié)86-87
  • 全文結(jié)論87-89
  • 參考文獻(xiàn)89-100
  • 文獻(xiàn)綜述 miRNA在非小細(xì)胞肺癌中的作用100-108
  • 參考文獻(xiàn)105-108
  • 攻讀博士期間發(fā)表論文情況108-109
  • 致謝109

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2 陳婷;非小細(xì)胞肺癌調(diào)強(qiáng)放射治療預(yù)后因素分析[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 王波;單向式全胸腔鏡下解剖性肺葉切除術(shù)治療早期非小細(xì)胞肺癌的學(xué)習(xí)曲線(xiàn)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 施桂清;血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合放化療治療非小細(xì)胞肺癌的療效及安全性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王靜;Eg5、Ki-67在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 覃建穎;IL-21和Tc1細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌患者外周血及癌灶中的變化及相互作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 張瑞;ⅢA-N2期非小細(xì)胞肺癌手術(shù)治療和放射治療的療效對(duì)比及相關(guān)預(yù)后因素的分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 石姣姣;基于多肽構(gòu)建抗腫瘤靶向藥物的應(yīng)用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

9 胡世霖;非小細(xì)胞肺癌中醫(yī)辨證分型與Napsin A、TTF-1在肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

10 王婷婷;細(xì)胞因子活化殺傷細(xì)胞治療非小細(xì)胞肺癌臨床研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號(hào):1031137

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