發(fā)布時間：2017-10-13 19:14

  本文關(guān)鍵詞：褪黑素對牙髓炎TLR4、NF-κB調(diào)節(jié)機制的相關(guān)研究

  更多相關(guān)文章： 褪黑素 牙髓炎 TLR4 NF-κB 天然免疫系統(tǒng)

【摘要】：牙髓炎引起的機體免疫防御反應(yīng)主要是通過齲病相關(guān)的細(xì)菌等微生物及其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致的,并且一般是通過牙本質(zhì)小管感染牙髓組織引起的。牙髓炎的免疫反應(yīng)有多種免疫細(xì)胞參與,其中樹突狀細(xì)胞在牙髓組織的天然免疫反應(yīng)中的作用最為重要。但是近年來的研究表明牙髓成纖維細(xì)胞在牙髓炎的發(fā)生發(fā)展過程中作用明顯,尤其牙髓成纖維細(xì)胞中表達(dá)的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)2、3、4以及5在炎癥信號通路方面的調(diào)節(jié)作用等被國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。TLRs是細(xì)胞膜表面最常見的一類受體蛋白分子,它可以發(fā)現(xiàn)入侵的外源性病源分子包括病原相關(guān)分子模式(pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs)和危險相關(guān)分子模式(damage Associated Molecular Patterns,DAMPs),啟動和調(diào)控炎癥發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的愈合過程。其中TLR4分子是識別內(nèi)毒素,參與炎癥發(fā)生發(fā)展的重要受體分子。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在LPS刺激人牙髓成纖維細(xì)胞后,TLR4、My D88、NF-κB信號通路對NLRP3和IL-1β兩種基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,但是其具體機制尚不明了。隨著人們生活節(jié)奏的加快、壓力增加,由睡眠障礙導(dǎo)致各種炎性相關(guān)疾病發(fā)生率增加,褪黑素(melatonin,MT)具有促進(jìn)睡眠、調(diào)節(jié)免疫等重要功能,可以降低巨噬細(xì)胞以及其他的免疫細(xì)胞中TLR4、NF-κB的信號通路的表達(dá),但是褪黑素對牙髓炎調(diào)節(jié)免疫作用及相關(guān)機制尚無相關(guān)報道。本實驗通過建立體內(nèi)外牙髓炎癥模型,并施加褪黑素藥物干預(yù)研究TLR4、NF-κB信號通路的變化,闡明褪黑素、TLR4、NF-κB信號通路與牙髓組織固有免疫的關(guān)系,為尋找牙髓炎癥新的治療方法奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容:1.大鼠牙髓炎模型的建立以及相關(guān)炎性因子IL-1β、TNF-α、褪黑素和TLR4、NF-κB的信號通路激活在牙髓炎發(fā)生過程中的作用2.褪黑素對牙髓炎相關(guān)炎性因子IL-1β、TNF-α和TLR4、NF-κB的信號通路調(diào)節(jié)機制3.褪黑素受體在人牙髓成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及與在牙髓炎中的作用方法:1.大鼠磨牙開髓法建立大鼠牙髓炎模型,HE染色確定牙髓炎的狀況,RT-PCR檢測牙髓中TLR4、NF-κB相關(guān)基因的表達(dá)水平,免疫組化觀察TLR4、NF-κB在牙髓中的表達(dá)情況,ELISA檢測血清中IL-1β、IL-18、TNF-α、褪黑素濃度以及牙髓中IL-1β和TNF-α的濃度。2.構(gòu)建大鼠牙髓炎模型,通過腹腔注射褪黑素施加藥物干預(yù)措施后,ELISA檢測牙髓中IL-1β和TNF-α的濃度,RT-PCR和免疫組化檢測牙髓中TLR4、NF-κB相關(guān)基因的表達(dá)水平。體外構(gòu)建人牙髓細(xì)胞牙髓炎模型,施加褪黑素干預(yù)后,RT-PCR檢測TLR4、NF-κB、IL-1β及TNF-αm RNA表達(dá)水平,western-blot檢測TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平,ELISA檢測細(xì)胞中IL-1β及TNF-α的濃度。3.應(yīng)用RT-PCR和免疫組化檢測人牙髓細(xì)胞中褪黑素受體的表達(dá),通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)特異性的減低褪黑素受體的表達(dá),LPS刺激人牙髓細(xì)胞,再施加褪黑素干預(yù)后,RT-PCR檢測TLR4、NF-κB、IL-1β及TNF-αm RNA表達(dá)水平,western-blot檢測TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平,ELISA檢測細(xì)胞中IL-1β及TNF-α的濃度。結(jié)果:1.成功建立大鼠牙髓炎模型,牙髓炎后血清中IL-1β、IL-18、TNF-α表達(dá)水平升高及牙髓組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平升高,血清中褪黑素含量先降低后升高;免疫組化結(jié)果顯示TLR4、NF-κB在炎癥部位表達(dá)量升高;牙髓組織中TLR4、NF-κB蛋白m RNA表達(dá)水平升高。2.與單純牙髓炎組相比,腹腔注射褪黑素后牙髓炎牙髓組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯下降;TLR4、NF-κB在炎癥部位表達(dá)量明顯下降;牙髓組織中TLR4、NF-κB蛋白m RNA表達(dá)水平明顯下降。與單純LPS刺激牙髓炎組比較,LPS刺激人牙髓細(xì)胞再施加褪黑素干預(yù)后牙髓細(xì)胞中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯下降;TLR4、NF-κB在細(xì)胞中表達(dá)量明顯下降;牙髓細(xì)胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白m RNA表達(dá)水平顯著下降。3.人牙髓細(xì)胞中MT1表達(dá)陽性,MT2幾乎無法檢測到,MT1被特異性的干擾后,褪黑素對于牙髓炎的抑制作用明顯減低,與MT1表達(dá)水平正常的牙髓炎組比較,LPS+褪黑素+MT1表達(dá)抑制組的人牙髓細(xì)胞中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯上升;TLR4、NF-κB在細(xì)胞中表達(dá)量明顯上調(diào);牙髓細(xì)胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白m RNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。結(jié)論:1.大鼠牙髓炎后血清IL-1β、TNF-α、IL-18及牙髓組織中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌都明顯升高但血清褪黑素含量下降。2.褪黑素可以抑制大鼠牙髓炎過程牙髓組織中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌;褪黑素可以抑制LPS刺激人牙髓成纖維細(xì)胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌。3.褪黑素抑制人牙髓成纖維細(xì)胞炎癥過程可能是通過褪黑素受體MT1發(fā)揮作用的。
【關(guān)鍵詞】：褪黑素 牙髓炎 TLR4 NF-κB 天然免疫系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.31
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-15
• 文獻(xiàn)回顧15-26
• 第一部分、牙髓炎模型的建立以及相關(guān)炎性因子IL-1β、TNF-α、褪黑素和蛋白TLR4、NF-κB的表達(dá)變化26-43
• 實驗一、大鼠牙髓炎模型的建立以及相關(guān)炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α 和褪黑素的表達(dá)變化27-36
• 1、材料和方法27-29
• 2、結(jié)果29-33
• 3、討論33-36
• 實驗二、大鼠牙髓炎模型的牙髓組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)變化36-43
• 1、材料和方法36-39
• 2、結(jié)果39-41
• 3、討論41-43
• 第二部分、褪黑素對牙髓炎影響的初步研究43-64
• 實驗一、褪黑素對大鼠牙髓炎中炎癥因子和TLR4、NF-κB的影響44-52
• 1、材料和方法44-45
• 2、結(jié)果45-49
• 3、討論49-52
• 實驗二、人牙髓細(xì)胞炎癥模型的建立及褪黑素對人牙髓細(xì)胞中炎性因子IL-1β、 TNF-α 等炎癥因子的影響52-64
• 1、材料和方法52-55
• 2、結(jié)果55-62
• 3、討論62-64
• 第三部分、人牙髓中褪黑素受體的表達(dá)研究64-82
• 實驗一、人牙髓細(xì)胞中MT1 受體的表達(dá)情況及意義65-69
• 1、材料和方法65-66
• 2、結(jié)果66-67
• 3、討論67-69
• 實驗二、MT1 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及相應(yīng)基因沉默細(xì)胞系的建立69-76
• 1、材料方法69-73
• 2、結(jié)果73-74
• 3、討論74-76
• 實驗三、MT1 沉默對HDPCs炎癥反應(yīng)的影響研究76-82
• 1、材料和方法76
• 2、結(jié)果76-80
• 3、討論80-82
• 全文小結(jié)82-83
• 參考文獻(xiàn)83-95
• 個人簡歷和研究成果95-96
• 致謝96

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本文編號：1026603