本文關(guān)鍵詞：褪黑素對牙髓炎TLR4、NF-κB調(diào)節(jié)機制的相關(guān)研究

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【摘要】：牙髓炎引起的機體免疫防御反應(yīng)主要是通過齲病相關(guān)的細菌等微生物及其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致的,并且一般是通過牙本質(zhì)小管感染牙髓組織引起的。牙髓炎的免疫反應(yīng)有多種免疫細胞參與,其中樹突狀細胞在牙髓組織的天然免疫反應(yīng)中的作用最為重要。但是近年來的研究表明牙髓成纖維細胞在牙髓炎的發(fā)生發(fā)展過程中作用明顯,尤其牙髓成纖維細胞中表達的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)2、3、4以及5在炎癥信號通路方面的調(diào)節(jié)作用等被國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。TLRs是細胞膜表面最常見的一類受體蛋白分子,它可以發(fā)現(xiàn)入侵的外源性病源分子包括病原相關(guān)分子模式(pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs)和危險相關(guān)分子模式(damage Associated Molecular Patterns,DAMPs),啟動和調(diào)控炎癥發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的愈合過程。其中TLR4分子是識別內(nèi)毒素,參與炎癥發(fā)生發(fā)展的重要受體分子。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在LPS刺激人牙髓成纖維細胞后,TLR4、My D88、NF-κB信號通路對NLRP3和IL-1β兩種基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,但是其具體機制尚不明了。隨著人們生活節(jié)奏的加快、壓力增加,由睡眠障礙導(dǎo)致各種炎性相關(guān)疾病發(fā)生率增加,褪黑素(melatonin,MT)具有促進睡眠、調(diào)節(jié)免疫等重要功能,可以降低巨噬細胞以及其他的免疫細胞中TLR4、NF-κB的信號通路的表達,但是褪黑素對牙髓炎調(diào)節(jié)免疫作用及相關(guān)機制尚無相關(guān)報道。本實驗通過建立體內(nèi)外牙髓炎癥模型,并施加褪黑素藥物干預(yù)研究TLR4、NF-κB信號通路的變化,闡明褪黑素、TLR4、NF-κB信號通路與牙髓組織固有免疫的關(guān)系,為尋找牙髓炎癥新的治療方法奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容:1.大鼠牙髓炎模型的建立以及相關(guān)炎性因子IL-1β、TNF-α、褪黑素和TLR4、NF-κB的信號通路激活在牙髓炎發(fā)生過程中的作用2.褪黑素對牙髓炎相關(guān)炎性因子IL-1β、TNF-α和TLR4、NF-κB的信號通路調(diào)節(jié)機制3.褪黑素受體在人牙髓成纖維細胞中的表達及與在牙髓炎中的作用方法:1.大鼠磨牙開髓法建立大鼠牙髓炎模型,HE染色確定牙髓炎的狀況,RT-PCR檢測牙髓中TLR4、NF-κB相關(guān)基因的表達水平,免疫組化觀察TLR4、NF-κB在牙髓中的表達情況,ELISA檢測血清中IL-1β、IL-18、TNF-α、褪黑素濃度以及牙髓中IL-1β和TNF-α的濃度。2.構(gòu)建大鼠牙髓炎模型,通過腹腔注射褪黑素施加藥物干預(yù)措施后,ELISA檢測牙髓中IL-1β和TNF-α的濃度,RT-PCR和免疫組化檢測牙髓中TLR4、NF-κB相關(guān)基因的表達水平。體外構(gòu)建人牙髓細胞牙髓炎模型,施加褪黑素干預(yù)后,RT-PCR檢測TLR4、NF-κB、IL-1β及TNF-αm RNA表達水平,western-blot檢測TLR4、NF-κB蛋白表達水平,ELISA檢測細胞中IL-1β及TNF-α的濃度。3.應(yīng)用RT-PCR和免疫組化檢測人牙髓細胞中褪黑素受體的表達,通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)特異性的減低褪黑素受體的表達,LPS刺激人牙髓細胞,再施加褪黑素干預(yù)后,RT-PCR檢測TLR4、NF-κB、IL-1β及TNF-αm RNA表達水平,western-blot檢測TLR4、NF-κB蛋白表達水平,ELISA檢測細胞中IL-1β及TNF-α的濃度。結(jié)果:1.成功建立大鼠牙髓炎模型,牙髓炎后血清中IL-1β、IL-18、TNF-α表達水平升高及牙髓組織中IL-1β、TNF-α表達水平升高,血清中褪黑素含量先降低后升高;免疫組化結(jié)果顯示TLR4、NF-κB在炎癥部位表達量升高;牙髓組織中TLR4、NF-κB蛋白m RNA表達水平升高。2.與單純牙髓炎組相比,腹腔注射褪黑素后牙髓炎牙髓組織中IL-1β、TNF-α表達水平明顯下降;TLR4、NF-κB在炎癥部位表達量明顯下降;牙髓組織中TLR4、NF-κB蛋白m RNA表達水平明顯下降。與單純LPS刺激牙髓炎組比較,LPS刺激人牙髓細胞再施加褪黑素干預(yù)后牙髓細胞中IL-1β、TNF-α表達水平明顯下降;TLR4、NF-κB在細胞中表達量明顯下降;牙髓細胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白m RNA表達水平顯著下降。3.人牙髓細胞中MT1表達陽性,MT2幾乎無法檢測到,MT1被特異性的干擾后,褪黑素對于牙髓炎的抑制作用明顯減低,與MT1表達水平正常的牙髓炎組比較,LPS+褪黑素+MT1表達抑制組的人牙髓細胞中IL-1β、TNF-α表達水平明顯上升;TLR4、NF-κB在細胞中表達量明顯上調(diào);牙髓細胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白m RNA表達水平明顯上調(diào)。結(jié)論:1.大鼠牙髓炎后血清IL-1β、TNF-α、IL-18及牙髓組織中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌都明顯升高但血清褪黑素含量下降。2.褪黑素可以抑制大鼠牙髓炎過程牙髓組織中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌;褪黑素可以抑制LPS刺激人牙髓成纖維細胞中TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的分泌。3.褪黑素抑制人牙髓成纖維細胞炎癥過程可能是通過褪黑素受體MT1發(fā)揮作用的。
【關(guān)鍵詞】：褪黑素 牙髓炎 TLR4 NF-κB 天然免疫系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.31
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-26
• 第一部分、牙髓炎模型的建立以及相關(guān)炎性因子IL-1β、TNF-α、褪黑素和蛋白TLR4、NF-κB的表達變化26-43
• 實驗一、大鼠牙髓炎模型的建立以及相關(guān)炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α 和褪黑素的表達變化27-36
• 1、材料和方法27-29
• 2、結(jié)果29-33
• 3、討論33-36
• 實驗二、大鼠牙髓炎模型的牙髓組織中TLR4、NF-κB蛋白表達變化36-43
• 1、材料和方法36-39
• 2、結(jié)果39-41
• 3、討論41-43
• 第二部分、褪黑素對牙髓炎影響的初步研究43-64
• 實驗一、褪黑素對大鼠牙髓炎中炎癥因子和TLR4、NF-κB的影響44-52
• 1、材料和方法44-45
• 2、結(jié)果45-49
• 3、討論49-52
• 實驗二、人牙髓細胞炎癥模型的建立及褪黑素對人牙髓細胞中炎性因子IL-1β、 TNF-α 等炎癥因子的影響52-64
• 1、材料和方法52-55
• 2、結(jié)果55-62
• 3、討論62-64
• 第三部分、人牙髓中褪黑素受體的表達研究64-82
• 實驗一、人牙髓細胞中MT1 受體的表達情況及意義65-69
• 1、材料和方法65-66
• 2、結(jié)果66-67
• 3、討論67-69
• 實驗二、MT1 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及相應(yīng)基因沉默細胞系的建立69-76
• 1、材料方法69-73
• 2、結(jié)果73-74
• 3、討論74-76
• 實驗三、MT1 沉默對HDPCs炎癥反應(yīng)的影響研究76-82
• 1、材料和方法76
• 2、結(jié)果76-80
• 3、討論80-82
• 全文小結(jié)82-83
• 參考文獻83-95
• 個人簡歷和研究成果95-96
• 致謝96

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本文編號：1026603