本文關鍵詞：Notch信號在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)元死亡中的作用及機制研究

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【摘要】：研究背景創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是指由諸如剪切、撕扯、牽拉等性質(zhì)的機械力對腦組織所造成的物理性損傷,可導致挫傷、出血和水腫等即刻的臨床效應。TBI是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病,致殘、死率極高。研究發(fā)現(xiàn),引起TBI的主要機制包括谷氨酸興奮性毒性、氧化應激、炎癥反應等等,而這些病理機制作用的最終結(jié)果則導致神經(jīng)元的死亡及其相關功能的喪失。嚴重腦損傷患者即使被挽救生命,但因為神經(jīng)元的死亡是無法再生替代的,因此損傷引起患者的多種功能缺陷仍的后期恢復還缺乏有效的治療措施,給家庭與社會造成巨大的經(jīng)濟負擔和精神負擔。目前對TBI后分子代謝及調(diào)控的機制還不十分清楚。因此,積極探索內(nèi)源性調(diào)控神經(jīng)元死亡和存活的關鍵分子成為TBI治療的重要策略。Notch信號作為一類在物種進化過程中高度保守的信號通路,在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。累積的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多種不同類型的腦損傷模型中均存在Notch信號的激活。通過化學抑制劑或基因調(diào)控的方法抑制Notch信號的活性及表達在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。然而,一些研究也報道抑制Notch信號加重了缺血性腦損傷后的神經(jīng)細胞損傷。這些矛盾的結(jié)論使Notch在神經(jīng)元損傷中的作用充滿爭議。因此,探索并了解Notch信號在TBI后發(fā)揮何種作用及相關的作用機制對于TBI的救治來說具有重要的理論和現(xiàn)實意義。實驗目的(1)探索Notch在TBI后的時空變化規(guī)律及功能;(2)探索Notch在TBI后神經(jīng)元凋亡和自噬中的作用及相關的機制;(3)探索TBI后自噬對凋亡的影響作用。實驗方法(1)細胞培養(yǎng):離體的皮層神經(jīng)元培養(yǎng);(2)造模:動物實驗采用液壓打擊致腦損傷模型,離體實驗使用機械性劃傷模型,分別模擬在體與離體條件下的創(chuàng)傷性腦損傷;(3)神經(jīng)元致傷效果:采用LDH試劑盒檢測細胞損傷破壞的程度,采用CCK8試劑盒檢測神經(jīng)元損傷后的存活數(shù)量;(4)分子表達與空間定位:分別采用免疫熒光、Western blot及免疫組化等方法檢測主要分子的表達規(guī)律及空間定位;(5)腦損傷程度:采用干濕重法檢測TBI后小鼠腦水腫的程度;采用神經(jīng)功能學評分評估TBI后小鼠神經(jīng)功能受損的程度;(6)細胞凋亡:western blot、Caspase檢測試劑盒以及TUNEL染色檢測細胞凋亡;(7)Notch調(diào)控:利用Notch信號抑制劑GSI及下調(diào)Notch信號在神經(jīng)元的表達,采用Notch激動劑重組鼠jagged1蛋白上調(diào)Notch信號的活性;(8)ERK通路調(diào)控:使用特異性阻斷劑PD98059抑制ERK通路的活性;(9)自噬調(diào)控:利用自噬抑制劑3-MA和自噬激動劑雷帕霉素分別來下調(diào)和上調(diào)自噬,并通過檢測LC3的蛋白表達反應自噬水平。實驗結(jié)果實驗一:與對照組比較,離體神經(jīng)元機械性劃傷模型可在傷后1h顯著升高神經(jīng)元LDH的漏出并減少存活細胞數(shù)量;劃傷后6h在光鏡下可見視野內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,Hochest染色顯示神經(jīng)元中的凋亡細胞數(shù)明顯增加,透射電鏡下可看到雙層膜的自噬體,免疫熒光結(jié)果顯示NICD主要定位于胞漿和胞核。在小鼠液壓打擊腦損傷模型中:與對照組比較TBI后出現(xiàn)明顯腦水腫及神經(jīng)功能障礙;TBI24h后TUNEL染色顯示損傷側(cè)皮層中TUNEL染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加,DAB染色顯示NICD陽性細胞較對照組顯著增加,主要定位在損傷側(cè)皮層部位神經(jīng)元的胞核中。此外,離體和在體的western blot檢測均顯示:TBI后神經(jīng)元中NICD、活化caspase3與LC3Ⅱ的表達均早期開始上調(diào),達到峰值后逐漸回落。實驗二:分別在離體和在體模型上給予Notch信號抑制劑GSI預處理,兩種模型上NICD的表達均受到明顯抑制。GSI顯著降低離體神經(jīng)元機械性劃傷6h后LDH漏出并增加了細胞存活。Western blot檢測顯示GSI明顯降低了細胞劃傷后的caspase3和LC3的激活。在體模型中與TBI組相比,GSI明顯降低了TBI后小鼠腦含水量并改善了其功能學評分,western blot檢測同樣顯示GSI預處理明顯降低了活化caspase 3和LC3Ⅱ的蛋白表達量,TUNEL檢測顯示給予GSI處理降低了TUNEL陽性細胞量。實驗三:離體培養(yǎng)的神經(jīng)元機械性劃傷后磷酸化ERK的表達從傷后1h出現(xiàn)高表達,隨后逐漸回落至24h恢復正常水平。使用ERK抑制劑PD98059預處理可明顯降低磷酸化ERK水平,同時活化caspase 3和LC3Ⅱ的表達也受到明顯抑制。PD98059顯著降低離體神經(jīng)元機械性劃傷后LDH漏出并增加了細胞存活率。使用GSI抑制Notch信號后,發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK明顯下降。同時給予Notch激動劑jagged1和PD98059后發(fā)現(xiàn)jagged1可明顯上調(diào)損傷后NICD、磷酸化ERK、活化caspase 3和LC3Ⅱ的蛋白表達,而jagged1的這些作用可被PD98059明顯抑制.實驗四:離體培養(yǎng)的神經(jīng)元機械性劃傷前1h給予自噬抑制劑3-MA和激動劑雷帕霉素預處理。損傷后6h發(fā)現(xiàn)3-MA可明顯降低LC3Ⅱ表達和神經(jīng)元存活率并增加細胞LDH漏出,TUNEL染色顯示3-MA明顯增加了TUNEL陽性細胞數(shù)量,同時雷帕霉素則發(fā)揮了完全相反的作用。最后使用caspase活性試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)激活自噬可能通過調(diào)控線粒體caspase 9活性來影響凋亡。實驗結(jié)論我們的研究結(jié)果證實,TBI后阻斷Notch信號可產(chǎn)生神經(jīng)保護效應;Notch信號可能與ERK相互作用共同調(diào)節(jié)了TBI后神經(jīng)元的凋亡和自噬;自噬在TBI后發(fā)揮神經(jīng)保護作用且調(diào)控自噬可影響TBI引起的神經(jīng)元凋亡。該研究結(jié)果證明了Notch參與神經(jīng)元TBI后死亡的調(diào)控,為TBI的機制研究和臨床治療提供了新的思路和視角。
【關鍵詞】：Notch ERK 創(chuàng)傷性腦損傷 凋亡 自噬
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-33
• 第一部分 Notch信號在TBI后的表達及定位33-54
• 1 材料33-36
• 2 方法36-46
• 3 結(jié)果46-52
• 4 討論52-54
• 第二部分 抑制Notch信號對小鼠TBI后的神經(jīng)保護作用54-63
• 1 材料54
• 2 方法54-55
• 3 結(jié)果55-60
• 4 討論60-63
• 第三部分 Notch信號通過ERK調(diào)節(jié)TBI后神經(jīng)元凋亡和自噬63-72
• 1 材料63
• 2 方法63-64
• 3 結(jié)果64-69
• 4 討論69-72
• 第四部分 自噬在TBI后神經(jīng)元凋亡中的作用72-80
• 1 材料72
• 2 方法72-74
• 3 結(jié)果74-77
• 4 討論77-80
• 小結(jié)80-81
• 參考文獻81-101
• 個人簡歷和研究成果101-102
• 致謝102

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本文編號：1017923