本文關(guān)鍵詞：Notch信號(hào)在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)元死亡中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是指由諸如剪切、撕扯、牽拉等性質(zhì)的機(jī)械力對(duì)腦組織所造成的物理性損傷,可導(dǎo)致挫傷、出血和水腫等即刻的臨床效應(yīng)。TBI是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病,致殘、死率極高。研究發(fā)現(xiàn),引起TBI的主要機(jī)制包括谷氨酸興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等等,而這些病理機(jī)制作用的最終結(jié)果則導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡及其相關(guān)功能的喪失。嚴(yán)重腦損傷患者即使被挽救生命,但因?yàn)樯窠?jīng)元的死亡是無(wú)法再生替代的,因此損傷引起患者的多種功能缺陷仍的后期恢復(fù)還缺乏有效的治療措施,給家庭與社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。目前對(duì)TBI后分子代謝及調(diào)控的機(jī)制還不十分清楚。因此,積極探索內(nèi)源性調(diào)控神經(jīng)元死亡和存活的關(guān)鍵分子成為T(mén)BI治療的重要策略。Notch信號(hào)作為一類在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路,在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。累積的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多種不同類型的腦損傷模型中均存在Notch信號(hào)的激活。通過(guò)化學(xué)抑制劑或基因調(diào)控的方法抑制Notch信號(hào)的活性及表達(dá)在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而,一些研究也報(bào)道抑制Notch信號(hào)加重了缺血性腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞損傷。這些矛盾的結(jié)論使Notch在神經(jīng)元損傷中的作用充滿爭(zhēng)議。因此,探索并了解Notch信號(hào)在TBI后發(fā)揮何種作用及相關(guān)的作用機(jī)制對(duì)于TBI的救治來(lái)說(shuō)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)探索Notch在TBI后的時(shí)空變化規(guī)律及功能;(2)探索Notch在TBI后神經(jīng)元凋亡和自噬中的作用及相關(guān)的機(jī)制;(3)探索TBI后自噬對(duì)凋亡的影響作用。實(shí)驗(yàn)方法(1)細(xì)胞培養(yǎng):離體的皮層神經(jīng)元培養(yǎng);(2)造模:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用液壓打擊致腦損傷模型,離體實(shí)驗(yàn)使用機(jī)械性劃傷模型,分別模擬在體與離體條件下的創(chuàng)傷性腦損傷;(3)神經(jīng)元致傷效果:采用LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞損傷破壞的程度,采用CCK8試劑盒檢測(cè)神經(jīng)元損傷后的存活數(shù)量;(4)分子表達(dá)與空間定位:分別采用免疫熒光、Western blot及免疫組化等方法檢測(cè)主要分子的表達(dá)規(guī)律及空間定位;(5)腦損傷程度:采用干濕重法檢測(cè)TBI后小鼠腦水腫的程度;采用神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分評(píng)估TBI后小鼠神經(jīng)功能受損的程度;(6)細(xì)胞凋亡:western blot、Caspase檢測(cè)試劑盒以及TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡;(7)Notch調(diào)控:利用Notch信號(hào)抑制劑GSI及下調(diào)Notch信號(hào)在神經(jīng)元的表達(dá),采用Notch激動(dòng)劑重組鼠jagged1蛋白上調(diào)Notch信號(hào)的活性;(8)ERK通路調(diào)控:使用特異性阻斷劑PD98059抑制ERK通路的活性;(9)自噬調(diào)控:利用自噬抑制劑3-MA和自噬激動(dòng)劑雷帕霉素分別來(lái)下調(diào)和上調(diào)自噬,并通過(guò)檢測(cè)LC3的蛋白表達(dá)反應(yīng)自噬水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)一:與對(duì)照組比較,離體神經(jīng)元機(jī)械性劃傷模型可在傷后1h顯著升高神經(jīng)元LDH的漏出并減少存活細(xì)胞數(shù)量;劃傷后6h在光鏡下可見(jiàn)視野內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,Hochest染色顯示神經(jīng)元中的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加,透射電鏡下可看到雙層膜的自噬體,免疫熒光結(jié)果顯示NICD主要定位于胞漿和胞核。在小鼠液壓打擊腦損傷模型中:與對(duì)照組比較TBI后出現(xiàn)明顯腦水腫及神經(jīng)功能障礙;TBI24h后TUNEL染色顯示損傷側(cè)皮層中TUNEL染色陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加,DAB染色顯示NICD陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組顯著增加,主要定位在損傷側(cè)皮層部位神經(jīng)元的胞核中。此外,離體和在體的western blot檢測(cè)均顯示:TBI后神經(jīng)元中NICD、活化caspase3與LC3Ⅱ的表達(dá)均早期開(kāi)始上調(diào),達(dá)到峰值后逐漸回落。實(shí)驗(yàn)二:分別在離體和在體模型上給予Notch信號(hào)抑制劑GSI預(yù)處理,兩種模型上NICD的表達(dá)均受到明顯抑制。GSI顯著降低離體神經(jīng)元機(jī)械性劃傷6h后LDH漏出并增加了細(xì)胞存活。Western blot檢測(cè)顯示GSI明顯降低了細(xì)胞劃傷后的caspase3和LC3的激活。在體模型中與TBI組相比,GSI明顯降低了TBI后小鼠腦含水量并改善了其功能學(xué)評(píng)分,western blot檢測(cè)同樣顯示GSI預(yù)處理明顯降低了活化caspase 3和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量,TUNEL檢測(cè)顯示給予GSI處理降低了TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞量。實(shí)驗(yàn)三:離體培養(yǎng)的神經(jīng)元機(jī)械性劃傷后磷酸化ERK的表達(dá)從傷后1h出現(xiàn)高表達(dá),隨后逐漸回落至24h恢復(fù)正常水平。使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理可明顯降低磷酸化ERK水平,同時(shí)活化caspase 3和LC3Ⅱ的表達(dá)也受到明顯抑制。PD98059顯著降低離體神經(jīng)元機(jī)械性劃傷后LDH漏出并增加了細(xì)胞存活率。使用GSI抑制Notch信號(hào)后,發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK明顯下降。同時(shí)給予Notch激動(dòng)劑jagged1和PD98059后發(fā)現(xiàn)jagged1可明顯上調(diào)損傷后NICD、磷酸化ERK、活化caspase 3和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá),而jagged1的這些作用可被PD98059明顯抑制.實(shí)驗(yàn)四:離體培養(yǎng)的神經(jīng)元機(jī)械性劃傷前1h給予自噬抑制劑3-MA和激動(dòng)劑雷帕霉素預(yù)處理。損傷后6h發(fā)現(xiàn)3-MA可明顯降低LC3Ⅱ表達(dá)和神經(jīng)元存活率并增加細(xì)胞LDH漏出,TUNEL染色顯示3-MA明顯增加了TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,同時(shí)雷帕霉素則發(fā)揮了完全相反的作用。最后使用caspase活性試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)激活自噬可能通過(guò)調(diào)控線粒體caspase 9活性來(lái)影響凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)論我們的研究結(jié)果證實(shí),TBI后阻斷Notch信號(hào)可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)效應(yīng);Notch信號(hào)可能與ERK相互作用共同調(diào)節(jié)了TBI后神經(jīng)元的凋亡和自噬;自噬在TBI后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用且調(diào)控自噬可影響TBI引起的神經(jīng)元凋亡。該研究結(jié)果證明了Notch參與神經(jīng)元TBI后死亡的調(diào)控,為T(mén)BI的機(jī)制研究和臨床治療提供了新的思路和視角。
【關(guān)鍵詞】：Notch ERK 創(chuàng)傷性腦損傷 凋亡 自噬
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.15
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-33
• 第一部分 Notch信號(hào)在TBI后的表達(dá)及定位33-54
• 1 材料33-36
• 2 方法36-46
• 3 結(jié)果46-52
• 4 討論52-54
• 第二部分 抑制Notch信號(hào)對(duì)小鼠TBI后的神經(jīng)保護(hù)作用54-63
• 1 材料54
• 2 方法54-55
• 3 結(jié)果55-60
• 4 討論60-63
• 第三部分 Notch信號(hào)通過(guò)ERK調(diào)節(jié)TBI后神經(jīng)元凋亡和自噬63-72
• 1 材料63
• 2 方法63-64
• 3 結(jié)果64-69
• 4 討論69-72
• 第四部分 自噬在TBI后神經(jīng)元凋亡中的作用72-80
• 1 材料72
• 2 方法72-74
• 3 結(jié)果74-77
• 4 討論77-80
• 小結(jié)80-81
• 參考文獻(xiàn)81-101
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果101-102
• 致謝102

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本文編號(hào)：1017923