本文關(guān)鍵詞：miR-9-3p與miR-146a-5p在2型糖尿病患者血漿中表達(dá)分析及功能研究

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【摘要】：糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是由于體內(nèi)胰島素絕對(duì)不足或相對(duì)不足所引起的以糖、脂代謝紊亂為主要特征的內(nèi)分泌代謝性疾病,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,居民體力活動(dòng)的下降和生活水平的不斷提高,糖尿病的患病率逐年升高。據(jù)2003年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球現(xiàn)有超過2億的糖尿病患者,到2025年預(yù)計(jì)這一數(shù)字將增長一倍。目前糖尿病分型包括1型糖尿病,2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM),妊娠期糖尿病以及其他特殊類型的糖尿病,其中T2DM患者占糖尿病患者總數(shù)的90%-95%。目前研究認(rèn)為T2DM是一種慢性低度炎癥反應(yīng)(Chronic low-grade i nflammatory disease),大量研究顯示,T2DM患者血液中常伴有脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、C反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein, CRP)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)、白介素-6 (Interleuk in-6, IL-6)等炎性因子水平升高。炎性因子及其效應(yīng)分子共同產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用,通過氧化應(yīng)激反應(yīng),激活核因子-1:B (nuclear factor-KB, NF-κB)、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitoge n-Activated Protein Kinase)、抑制物激酶(Inhibitor of nuclear fa ctor Kappa-B Kinase, IKK)等炎性反應(yīng)系統(tǒng),不僅損傷胰島細(xì)胞線粒體,加速胰島p細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致胰島素分泌不足,還可引起內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的異常,導(dǎo)致胰島素在組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)障礙從而促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生。流行病學(xué)研究認(rèn)為,T2DM患者存在獨(dú)特的血脂情況：甘油三酯(Triglyceride, TG)與低密度脂蛋白膽固醇(Low-Density Lipoprotein Cholesterol, LDL-C)水平的升高、高密度脂蛋白膽固醇(High-Density Lipoprotein Cholesterol, HDL-C)水平的降低,研究認(rèn)為,形成這種血脂狀態(tài)的主要原因是由于細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)受體功能異常。盡管T2DM患者常伴慢性低度炎癥反應(yīng)與脂代謝的紊亂,但慢性炎癥反應(yīng)對(duì)細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子的影響卻鮮有研究。小分子核糖核酸(nicroRNA, miRNA)是一類長度約為20-24個(gè)核苷駿長度的非編碼單鏈小RNA分子,通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶向mRNA陽結(jié)合,形成沉默復(fù)合體(RNA-Induced Silencing Complex, RISC), RISC對(duì)其靶向基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制作用。miRNA不僅存在于細(xì)胞內(nèi)也存于循環(huán)系統(tǒng)中,研究表明,同一個(gè)體在相同狀態(tài)下血漿miRNA表達(dá)譜大致相同,在疾病狀態(tài)下,miRNA會(huì)選擇性地從組織細(xì)胞釋放到外周血中發(fā)揮作用[7]或通過血液傳遞到受體細(xì)胞發(fā)揮作用,這就使得血漿中niRNA的表達(dá)水平發(fā)生變化,且血漿中miRNA的變化要早于蛋白類標(biāo)記物,以上特點(diǎn)使血漿rniRNA具有成為一種全新疾病檢測(cè)標(biāo)記物的潛能。人類miR-9-3p是miRNA家族成員之一,其基因定位于15號(hào)染色體,首次發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為是一種腦源性miRNA,目前國外研究表明,miR-9-3p具有調(diào)節(jié)胰島素分泌、促進(jìn)胰島素抵抗的作用,因此niR-9-3p在糖尿病領(lǐng)域的研究頗受重視。miR-146a-5p是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)功能的niRNA,研究認(rèn)為niR-146a-5p參與了慢性炎癥的病理過程,其基因位人第5號(hào)染色體,目前miR-146a-5p在慢性炎癥相關(guān)疾病中的研究頗受重視�，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,新發(fā)T2DM患者血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞中檢測(cè)到miR-9-3p的水平顯著升高,T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-L46a-5p水平顯著低于正常對(duì)照組,目前國內(nèi)外對(duì)于單純T2DM患者血漿中miR-9-3p、miR-146a-5p表達(dá)水平變化的研究甚少,臨床上將miR-9 ·3p、miR-146a-5p血漿表達(dá)水平作為T2DM的新型診斷標(biāo)記物尚缺乏充足的證據(jù)。目前關(guān)于miR-9-3p的功能性研究顯示：胰島p細(xì)胞內(nèi)niR-9-3p表達(dá)含量升高,能夠降低p細(xì)胞胰島素分泌的能力,能夠抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuin Type 1,Sirt1)蛋白水平。目前研究認(rèn)為,Sirt1基因?qū)τ谔岣呓M織胰島素敏感性、促進(jìn)胰島素分泌和調(diào)節(jié)脂類代謝的平衡發(fā)揮重要作用。Ramachandran D的研究表明,在葡萄糖刺激的胰島素分泌過程中,胰島p細(xì)胞中rniR-9-3p表達(dá)水平會(huì)顯著升高,而Sirt1蛋白水平顯著減少,三體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)Sirt1能夠正向促進(jìn)胰島素分泌,降低組織胰島素抵抗水平。Plaisance V于2006年證實(shí),當(dāng)胰島p細(xì)胞內(nèi)miR-9-3 P過度表達(dá)時(shí),miR-9-3p通過作用于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Onecut 2來增加胰島細(xì)胞內(nèi)Granaphilin-a蛋白的分泌,而Granuphilin-a蛋白的作用就是降低胰島p細(xì)胞外分泌能力。目前國內(nèi)外關(guān)于miR-9-3p對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗及脂類代謝調(diào)節(jié)相關(guān)因子Sirt1蛋白表達(dá)的影響未見報(bào)道。目前關(guān)于miR-146a-5p的功能研究認(rèn)為,rniR-146a-5p可能是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在炎癥修復(fù)、抑制炎癥反應(yīng)階段發(fā)揮重要作用。研究表明：在LPS所誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)中,miR-146a-5p通過抑制其靶基因白介素受體相關(guān)激酶-1(Interleukin receptor-associated kinase-1,IRAK-1)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor, TRAF6)等蛋白的表達(dá),減少下游炎癥因子的釋放。Taganov等研究顯示：LPS誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng),miR-146a-5p通過其3'非編碼區(qū)(3'Untranslated Regions,3'UTR)與炎性基因IRAK-1和TRAF6結(jié)合,通過下調(diào)IRAK-1信號(hào)途徑,抑制炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá),發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。Cie YF等應(yīng)用LPS誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)niR-146a-5p具有抑制IRAK-1轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平的表達(dá)。目前關(guān)于HepG2細(xì)胞炎性反應(yīng)狀態(tài)下,細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子IRAK-1、膽固醇代射相關(guān)因子ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1 (ATP-Binding Cassette Transporter G1, ABCG 1)與肝X受體α(Liver X Receptors alpha, LXRa)的蛋白表達(dá)水平尚未見文獻(xiàn)報(bào)道；關(guān)于HepG2細(xì)胞炎性反應(yīng)狀態(tài)下,miR-146a-5p發(fā)揮的抑制炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)因子的作用尚未見報(bào)道。HepG2細(xì)胞,是一種表型與肝細(xì)胞極為相似的人肝癌細(xì)胞株,其表面表達(dá)高親和力的胰島素受體,并且保留了肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性,包括葡萄糖攝取、糖原合成酶的活性、脂類生成及RNA的合成等,目前常被用作胰島素抵抗模型的建立、肝臟能量代謝及膽固醇代謝相關(guān)因子研究的細(xì)胞模型,如Melin B于1990應(yīng)用HepG2細(xì)胞成功建立肝細(xì)胞胰島素抵抗模型,Park H以及Kamble P分別以HepG2細(xì)胞為細(xì)胞模型,研究了藥物對(duì)于肝臟脂質(zhì)沉積的影響并成功檢測(cè)了肝細(xì)胞胰島素抵抗相關(guān)因子Sirt1的表達(dá)水平,Adlakha YK等應(yīng)用HepG2細(xì)胞為模型,成功研究niRNA-128-2調(diào)節(jié)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1ATP-Binding Cassette Transporter Al, ABCA)、ABCG1表達(dá)的影響,本實(shí)驗(yàn)選用HepG2細(xì)胞為細(xì)胞模型,進(jìn)行miR-9-3p以及miR-146a-5p的相關(guān)功能學(xué)研究。LPS是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成部分,是牙齦卟啉單胞菌Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide, P.g表面最主要的致病因子,P.gLPS具有很強(qiáng)的抗原性,研究報(bào)道P.gLPS能夠與血漿中LPS結(jié)合蛋白相結(jié)合,引起單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等宿主細(xì)胞的一系列免疫反應(yīng)。目前關(guān)于miR-9-3p對(duì)HepG2田胞Sirtl蛋白水平表達(dá)的靶向抑制作用未見報(bào)道,關(guān)于miR-146a-5p對(duì)P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞炎性反應(yīng)狀態(tài)下,細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)因子IRAK-1蛋白表達(dá)水平、膽固醇代謝相關(guān)因子ABCG1與LXRα蛋白表達(dá)水平的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本課題首先選取2012年1月至2013年6月我院內(nèi)分泌科收治住院的符合1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的單純T2DM患者47例為T2DM組,同時(shí)選取年齡、性別等與之相匹配的體檢健康人員28例為健康對(duì)照組,以miR-423-5p為內(nèi)參,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-9-3p.miR-146a-5p在體檢建康人群,T2DM患者血漿中表達(dá)水平的變化,應(yīng)用受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic curve,ROC)分析血漿miR-9-3p與miR-146a-5p對(duì)于2型糖尿病的診斷價(jià)值,本研究證實(shí)T2DM組血漿miR-9-3p的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組,T2DM組血漿rniR-146a-5p的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,血漿miR-9-3p. niR-146a-5p有望成為T2DM診斷潛在分子標(biāo)記物。第二部分,本課題以HepG2細(xì)胞為切入點(diǎn),進(jìn)一步通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、轉(zhuǎn)染技術(shù)及蛋白印跡技術(shù)對(duì)miR-9-3p進(jìn)行功能性研究。本實(shí)驗(yàn)通過miR-9-3p mimics轉(zhuǎn)染技術(shù)研究miR-9-3p對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗及膽固醇代謝相關(guān)蛋白Sirtl的靶向抑制作用,研究證實(shí),在HepG2田胞中,miR-9-3p在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)Sirt1的表達(dá)無影響,miR-9-3p能夠顯著抑制Sirt1蛋白的表達(dá),表明miR-9-3p通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Sirt1基因表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞胰島素抵抗的作用。第三部分,本課題以HepG2細(xì)胞為切入點(diǎn),從炎癥以及膽固醇代謝的角度,應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、轉(zhuǎn)染技術(shù)和蛋白印跡技術(shù)以P.gLP S刺敷以及miR-146a-5p mimics轉(zhuǎn)染為干預(yù)手段,研究P.gLPS刺激、miR-1 16a-5p轉(zhuǎn)染以及miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激三種處理方法分別對(duì)HepG2細(xì)胞炎癥相關(guān)因子IRAK-1、膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子ABCG1、膽固醇與炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)因子LXRα蛋白水平的表達(dá)影響,研究證實(shí),P.gLPS刺激能夠顯著升高HepG2田胞IRAK-1蛋白與ABCG1蛋白水平；轉(zhuǎn)染miR-146a-5p模擬物顯著下調(diào)HepG2田胞IRAK-1蛋白水平；轉(zhuǎn)染miR-146a-5p模擬物拮抗了P.gLPS刺激的HepG2田胞IRAK-1蛋白的上調(diào)；轉(zhuǎn)染niR-146a-5p模擬物拮抗了P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞ABCG1蛋白的上凋。通過本研究確定T2DM患者血漿miR-9-3p和miR-146a-5p表達(dá)水平；深入探討miR-9-3p促進(jìn)細(xì)胞胰島素抵抗的作用；檢測(cè)慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)HepG2細(xì)胞炎性因子以及膽固醇代謝調(diào)控因子的蛋白水平表達(dá)情況；以及miR-146a-5p發(fā)揮的抑制細(xì)胞炎癥、調(diào)節(jié)膽固醇代謝的作用,以期從細(xì)胞層面闡述miRNA對(duì)于胰島素抵抗、炎性反應(yīng)、膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)作用。為闡明T2DM相關(guān)的細(xì)胞炎性反應(yīng)、胰島素抵抗、脂代謝異常的病因?qū)W基礎(chǔ)和治療領(lǐng)域的探索提供新的思路。第一部分miR-9-3p與miR-146a-5p在2型糖尿病患者血漿中表達(dá)分析目的：確定miR-9-3p.miR-146a-5p在體檢健康人群、T2DM患者血漿中的表達(dá)變化。方法：本實(shí)驗(yàn)選取2012年1月至2013年6月我院內(nèi)分泌科收治住院的單純T2DM患者47例其中男性27例,女性20例為T2DM組；我院體險(xiǎn)中心的體檢健康人員28例其中男性14例,女性14例為對(duì)照組。所有研究對(duì)象禁食12小時(shí),清晨空腹肘靜脈采血6 mL,分別置于EDTA抗凝采血管3mL,普通生化管3mL,普通生化管靜脈血用于測(cè)定空腹血糖(Fasting Plasma Glueose, FPG)、餐后2小時(shí)血糖(TWO hours Plasma Glueose,2hPG).血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)等臨床指標(biāo)。EDTA吭凝的采血管采用4℃、3000r/min離心20分鐘,分離血漿及血細(xì)胞分別置于1.5mL無酶EP管內(nèi),進(jìn)一步將血漿EP管于4℃、12000g離心10min,輕輕吸取上層血漿置于1.5mL無酶EP管內(nèi),提取血漿總RNA,應(yīng)用raqMan探針miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),以miR-423-5p為內(nèi)參檢測(cè)丙組血漿中miR-9-3p與miR-146a-5p含量的表達(dá)水平,進(jìn)一步應(yīng)用ROC曲線分析血漿miR-9-3p與miR-146a-5p對(duì)于T2DM的診斷價(jià)值,以期為T2DM的早期預(yù)防、早期診斷提供可靠的分子標(biāo)記物。臨床計(jì)數(shù)資料使用n(%)表示,計(jì)量資料使用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示；丙組間數(shù)據(jù)比較計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),計(jì)量數(shù)據(jù)兩組間比較采用t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△CT法進(jìn)行分析,應(yīng)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(四分位間距)來表示,兩組數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)t檢驗(yàn)。P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,應(yīng)用SPSS160統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,GraphPAD Prism 5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。結(jié)果：1 研究人群基本特征本實(shí)驗(yàn)共入選單純T2DM患者47名其中男性27名女性20名,健康體檢人員28名其中男性14名女性14名,兩組間平均年齡分別為54±10歲、55±7歲�；咎卣鳎盒詣e、年齡、BMI、吸煙、高血壓兩組間比較未見顯著性差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)室檢查：TC、TG、LDL-C、HDL-C兩組間比較無顯著性差異(P0.05)；兩組間FPG、2hPG、HbA1C水平存在顯著性差異(P0.05)(Table1)2 血漿中miR-9-3p 與 miR-146a-5p表達(dá)水平2.1T2DM組血漿miR-9-3p的表達(dá)水平為0.033(0.004,0.209),對(duì)照組血漿niR-9-3p的表達(dá)水平為0.004(0.002,0.006)(Table2)。與對(duì)照組相比,T2DM組血漿niR-9-3p的表達(dá)水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0005) (Fig.1)2.2T2DM組血漿miR-146a-5p的表達(dá)水平為0.016(0.003,0.153),對(duì)照組血漿miR-146a-5p的表達(dá)水平為0.823±0.478 (Table2)。與對(duì)照組相比,T2DM組血漿niR-146a-5p的表達(dá)水平顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0001) (Fig.2)。3 ROC曲線分析血漿miR-9-3p與miR-146a-5p對(duì)于T2DM的診斷價(jià)值3.1 以體檢健康人群為對(duì)照組,評(píng)價(jià)miR-9-3p對(duì)于T2DM的診斷價(jià)值,3.OC曲線分析顯示：AUC=0.742,介于0.7-0.9之間,說明niR-9-3p對(duì)于2型糖尿病精準(zhǔn)診斷有一定準(zhǔn)確性(95%CI,0.628-0.857, P=0.0005)(Fig.3)3.2 以體檢健康人群為對(duì)照組,評(píng)價(jià)miR-146a-5p對(duì)于T2DM的診斷價(jià)值,ROC曲線分析顯示：AUC=0.947在0.9以上,說明miR-146a-5p對(duì)于2型糖尿病精準(zhǔn)診斷具有較高準(zhǔn)確性(95%CI,0.901-0.993,P0.0001)(Fig.4)。小結(jié)：1 T2DM組血漿rniR-9-3p的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 T2DM組血漿rniR-146a-5p的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3血漿rniR-9-3p與miR-146a-5p有望成為T2DM精準(zhǔn)診斷潛在分子標(biāo)記物,其真正的臨床意義有待于進(jìn)一步研究。第二部分miR-9-3p對(duì)HepG2細(xì)胞Sirtl蛋白表達(dá)的影響目的：探討rniR-9-3p是否影響HepG2細(xì)胞Sirt1表達(dá)水平。方法：以HepG2田胞為體外細(xì)胞模型,HepG2細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染rniR-9-3p nimics為轉(zhuǎn)染組；陰性對(duì)照組未轉(zhuǎn)染miR-9-3p mimics,其它培養(yǎng)條件與轉(zhuǎn)染組相同。應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及蛋白印跡,從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)miR-9-3p是否影響HepG2細(xì)胞Sirtl的表達(dá)。qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-△CT進(jìn)行分析,兩個(gè)獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,應(yīng)用SPSS160統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,GraphPAD Prism 5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。結(jié)果：1 miR-9-3p 對(duì) HepG2細(xì)胞Sirt1轉(zhuǎn)錄水平的影響通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),檢測(cè)陰性對(duì)照組和miR-9-3p轉(zhuǎn)染組Sirt1基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。結(jié)果表明,Sirt1基因mRNA水平在轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組無顯著性差異(P=0.30) (Fig.5),表明miR-9-3p在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)Sirt1的表達(dá)沒有影響。2 miR-9-3p 對(duì) HepG2田胞Sirtl蛋白水平的影響通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和Western blot技術(shù),檢測(cè)miR-9-3p對(duì)HepG2田胞Sirt1基因蛋白水平的表達(dá)變化。Western blot結(jié)果顯示,miR-9-3p轉(zhuǎn)染組Sirt1蛋白水平顯著低于陰性對(duì)照組(Fig.6、Fig.7),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017),表明miR-9-3p在蛋白水平調(diào)節(jié)Sirtl的表達(dá)。小結(jié)：1在HepG2田胞中,miR-9-3p在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)Sirt1的表達(dá)無影響。2在HepG2細(xì)胞中,miR-9-3p能夠抑制Sirt1蛋白的表達(dá),表明miR-9-3p通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Sirt1基因表達(dá)。第三部分miR-146a-5p對(duì)P.gLPS刺激的HepG2田胞IRAK-1、ABCG1與LXRα蛋白表達(dá)的影響目的：探討miR-146a-5p是否影響P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞IRAK-1、 ABCG1 與LXRα蛋白水平的表達(dá)。方法：以HepG2田胞為體外細(xì)胞模型,應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、轉(zhuǎn)染技術(shù)和蛋白印跡技術(shù),分別以P.gLPS刺激、miR-146a-5p mimics轉(zhuǎn)染為干預(yù)手段,實(shí)驗(yàn)分為四組：(1)HepG2細(xì)胞體外P.gLPS刺激為P.gLPS刺激組；(2)HepG2細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染rniR-146a-5p mimics為miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組；(3) HepG2田胞體外轉(zhuǎn)染rniR-146a-5p mimics后經(jīng)P.gLPS刺激為miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組；(4)陰性對(duì)照組未經(jīng)P.gLPS刺激未轉(zhuǎn)染rniR-146a-5p mimics,其它培養(yǎng)條件與各組相同。本部分實(shí)驗(yàn)從蛋白水平檢測(cè)P.gLPS刺激組、miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組、miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS束0激組、陰性對(duì)照組四組HepG2細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白IRAK-1、膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白ABCG1、膽固醇與炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白LXRa蛋白水平的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩個(gè)獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,GraphPAD Prism 5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。結(jié)果：1 P.gLPS對(duì)HepG2田胞IRAK-1蛋白水平的影響應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)P.gLPS刺激對(duì)HepG2田胞IRAK-1蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示,P.gLPS刺激組IRAK-1蛋白水平顯著高于陰性對(duì)照組(Fig.8、Fig.12、Fig.15),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.026)證實(shí)P.gLVS在蛋白水平對(duì)IRAK-1進(jìn)行調(diào)節(jié)。2 P.gLPS對(duì)HepG2細(xì)胞ABCG1蛋白水平的影響應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)P.gLPS刺激對(duì)HepG2田胞ABCG1在蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示,P.gLPS刺激組ABCG1蛋白水平顯著高于陰性對(duì)照組(Fig.9、Fig.13、Fig.16),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020)說明P.gLPS在蛋白水平對(duì)ABC G1進(jìn)行調(diào)節(jié)。3 P.gLPS對(duì)HepG2細(xì)胞LXRa蛋白水平的影響通過Western blot技術(shù)檢測(cè)P.gLPS激對(duì)HepG2細(xì)胞LXRα上蛋日水平的變化情況。結(jié)果顯示,P.gLPS刺激組LXRα蛋白水平與陰性對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.10、Fig.14) (P0.05)。4 miR-146a-5p對(duì)HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白水平的影響通過Western blot技術(shù)檢測(cè)rniR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞IRAK-1在蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示,miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組IRAK-1蛋白水平顯著低于陰性對(duì)照組(Fig.11、Fig.12、Fig.15),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028),說明miR-146a-5p在蛋白水平對(duì)IRAK-1進(jìn)行調(diào)節(jié)。5miR-146a-5p對(duì) HepG2細(xì)胞ABCG1蛋白水平的影響通過Western blot技術(shù)檢測(cè)niR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞ABCG1在蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示,miR-146a-5p轉(zhuǎn)染組ABCG1蛋白水平與陰性對(duì)照組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) (Fig.13、 Fig.16),說明miR-146-5p在蛋白水平對(duì)ABCG1未產(chǎn)生顯著影響。6miR-146a-5p對(duì)HepG2細(xì)胞LXRa蛋白水平的影響通過Western blot技術(shù)檢測(cè)niR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2田胞LXRa在蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示,niR-146a-5p轉(zhuǎn)染組LXRa蛋白水平與陰性對(duì)照組相比未見顯著性差異(P0.05) (Fig.14),說明miR-146-5p在蛋白水平對(duì)LXRa未產(chǎn)生顯著影響。7 miR-146a-5p對(duì)P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白水平的影響通過Western blot技術(shù)檢測(cè)rniR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞IRAK-1在蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示,與單純P.gLPS刺激組相比miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組能夠顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白水平(Fig.12、Fig.15),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)8 miR-146a-5p對(duì)P.gLPS刺激的HepG2細(xì)田胞ABCG1蛋白水平的影響通過Western blot技術(shù)檢測(cè)rniR-146a-5 P模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞ABCG1在蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示,與單純P.gLPS刺激組相比miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLP S刺激組顯著下調(diào)HepG2田胞ABCG1蛋白水平(Fig.13、Fig.16),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)9 miR-146a-5p對(duì)P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞LXRa蛋白水平的影響通過Western blot技術(shù)檢測(cè)rmiR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞LXRa在蛋白水平的變化情況。結(jié)果顯示,miR-146a-5p轉(zhuǎn)染+P.gLPS刺激組HepG2細(xì)胞LXRa蛋白水平與單純P.gLPS刺激組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.14)(P0.05)小結(jié)：1 P.gLPS刺激能夠顯著升高HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白水平。2 P.gLPS刺激能夠顯著升高HepG2細(xì)胞ABCG1蛋白水平。3轉(zhuǎn)染miR-146a-5p模擬物顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白水平。4轉(zhuǎn)染miR-146a-5p模擬物拮抗了P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞IRAK-1蛋白的上調(diào)。5轉(zhuǎn)染miR-146a-5 P模擬物拮抗了P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞ABCG1蛋白的上調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：microRNA 2型糖尿病 HepG2細(xì)胞 Sirt1 P.gLPS IRAK-1 ABCG1 LXRα
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1
【目錄】：

• 中文摘要5-15
• 英文摘要15-24
• 英文縮寫24-27
• 引言27-29
• 第一部分 mi R93p與miR-146a-5p在2型糖尿病患者血漿中表達(dá)分析29-54
• 前言29-31
• 材料與方法31-35
• 結(jié)果35-37
• 附圖37-41
• 附表41-43
• 討論43-47
• 小結(jié)47
• 參考文獻(xiàn)47-54
• 第二部分 mi R93p對(duì)HepG2 細(xì)胞Sirt1 蛋白表達(dá)的影響54-75
• 前言54-55
• 材料與方法55-63
• 結(jié)果63-65
• 附圖65-67
• 討論67-70
• 小結(jié)70-71
• 參考文獻(xiàn)71-75
• 第三部分 miR-146a-5p對(duì)P.gLPS刺激的HepG2細(xì)胞IRAK-1、ABCG1與LXRα 蛋白表達(dá)的影響75-106
• 前言75-77
• 材料與方法77-84
• 結(jié)果84-86
• 附圖86-91
• 討論91-97
• 小結(jié)97
• 參考文獻(xiàn)97-106
• 結(jié)論106-107
• 綜述一 microRNA在2型糖尿病中的作用107-122
• 參考文獻(xiàn)115-122
• 綜述二 microRNA在高糖狀態(tài)下對(duì)心血管的作用122-138
• 參考文獻(xiàn)131-138
• 致謝138-139
• 個(gè)人簡歷139

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本文編號(hào)：1007588