本文關(guān)鍵詞：應(yīng)激對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)及功能調(diào)節(jié)的作用機(jī)制研究

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【摘要】：線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝“工廠(chǎng)”,是細(xì)胞代謝的重要器官。線(xiàn)粒體具有半自主性,即線(xiàn)粒體擁有獨(dú)立的DNA,從而使得線(xiàn)粒體蛋白受到細(xì)胞核DNA與線(xiàn)粒體DNA雙重調(diào)控。己知99%的線(xiàn)粒體蛋白由細(xì)胞核DNA編碼調(diào)控,需要經(jīng)過(guò)在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄、翻譯形成攜帶特殊信號(hào)序列的前體蛋白,這些前體蛋白在細(xì)胞質(zhì)伴侶蛋白的協(xié)助下,通過(guò)位于線(xiàn)粒體膜上蛋白輸入系統(tǒng),輸入到線(xiàn)粒體特定不同區(qū)域。輸入至線(xiàn)粒體的前體蛋白在基質(zhì)伴侶蛋白作用下形成成熟蛋白,最終在線(xiàn)粒體呼吸鏈或線(xiàn)粒體基質(zhì)中發(fā)揮作用。由此看來(lái),骨骼肌線(xiàn)粒體蛋白輸入系統(tǒng)是影響骨骼肌線(xiàn)粒體生物發(fā)生的重要環(huán)節(jié),是線(xiàn)粒體生物發(fā)生得以順利進(jìn)行的物質(zhì)保證。線(xiàn)粒體蛋白輸入機(jī)制(PIM, Protein Import Machinery)涉及線(xiàn)粒體蛋白輸入系統(tǒng)相關(guān)組件及不同線(xiàn)粒體蛋白輸入通路的功能。其中,線(xiàn)粒體蛋白輸入系統(tǒng)的組件構(gòu)成非常復(fù)雜,包括線(xiàn)粒體外膜轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物TOM、線(xiàn)粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物TIM、線(xiàn)粒體基質(zhì)伴侶蛋白以及細(xì)胞質(zhì)中協(xié)助前體蛋白輸入的伴侶蛋白等諸多組件。 目的：本研究主要以PGC-1α、Bax/Bak基因?yàn)榍腥朦c(diǎn),根據(jù)PGC-1α、Bax/Bak基因的不同特征,通過(guò)分別深入研究PGC-1α、Bax/Bak基因與線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)以及線(xiàn)粒體PIM功能的關(guān)系,探討不同應(yīng)激對(duì)線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)及功能調(diào)節(jié)的分子作用機(jī)制,一方面首次關(guān)注PGC-1α、Bax/Bak基因是否對(duì)線(xiàn)粒體PIM具有調(diào)節(jié)作用,另一方面揭示調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體PIM的分子機(jī)制。 方法： 1. PGC-1α基因?qū)趋兰【�(xiàn)粒體PIM作用機(jī)制研究 1)細(xì)胞水平對(duì)PGC-1α基因的基礎(chǔ)性研究：采用C2C12肌細(xì)胞模型,對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行分化,生成可收縮的成熟肌管細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)主要采用急性電刺激成熟肌細(xì)胞模型以及結(jié)合使用多種特異性抑制劑：如NAC (ROS↓)、BAPTA-AM (Ca2+↓)、Compound c (AMPK↓)、BIRB796(p38↓)等。觀(guān)察急性電刺激條件下,不同分子信號(hào)通路對(duì)PGC-1α基因在轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯后蛋白水平的調(diào)控。 實(shí)驗(yàn)Ⅰ：分為對(duì)照組、急性電刺激組以及急性電刺激恢復(fù)組。Western Blot方法檢測(cè)PGC-1α基因相關(guān)分子信號(hào)通路蛋白表達(dá),免疫熒光法檢測(cè)急性電刺激對(duì)肌管細(xì)胞內(nèi)PGC-1α蛋白遷移的影響。 實(shí)驗(yàn)Ⅱ：分為對(duì)照組、對(duì)照組+抑制劑處理組、急性電刺激組、急性電刺激+抑制劑處理組。在肌細(xì)胞內(nèi)利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),轉(zhuǎn)染預(yù)構(gòu)建的i)含小鼠PGC-1α基因啟動(dòng)子全序列的熒光素質(zhì)�；騣i)含PGC-1α蛋白DNA全序列的熒光素質(zhì)粒,熒光素酶檢測(cè)法分別檢測(cè)不同分子信號(hào)通路對(duì)PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄活性以及輔激活轉(zhuǎn)錄活性的影響。 2)動(dòng)物水平對(duì)PGC-1α基因與線(xiàn)粒體PIM關(guān)系進(jìn)行研究：采用PGC-1α基因敲除鼠動(dòng)物模型,對(duì)比研究PGC-1α野生型及基因敲除小鼠骨骼肌線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)以及PIM功能。 實(shí)驗(yàn)分組：PGC-1α WT組與PGC-1α KO組。Western Blot方法檢測(cè)不同線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá),放射性同位素35s標(biāo)記示蹤法檢測(cè)線(xiàn)粒體PIM功能。 2. Bax/Bak基因?qū)趋兰【�(xiàn)粒體PIM作用機(jī)制研究 動(dòng)物水平對(duì)Bax/Bak基因與線(xiàn)粒體PIM關(guān)系進(jìn)行研究：采用Bax/Bak雙基因敲除鼠動(dòng)物模型,對(duì)比研究Bax/Bak基因的促細(xì)胞調(diào)亡特性及非促細(xì)胞凋亡特性,Bax/Bak野生型及雙基因敲除小鼠骨骼肌線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)以及PIM功能。 實(shí)驗(yàn)分為Bax/Bak WT組與Bax/Bak DKO組。Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞素色C釋放、線(xiàn)粒體融裂主要蛋白表達(dá)、線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)。JC-1線(xiàn)粒體跨膜電位指示劑檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位。放射性同位素35S標(biāo)記示蹤法檢測(cè)線(xiàn)粒體PIM功能。 3.骨骼肌線(xiàn)粒體PIM運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性研究 動(dòng)物水平對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體PIM運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性分子機(jī)制進(jìn)行研究：采用Bax/Bak雙基因敲除鼠動(dòng)物,結(jié)合6周自主性跑輪運(yùn)動(dòng)模型,對(duì)比研究Bax/Bak野生型及雙基因敲除小鼠在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練條件下骨骼肌線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)及功能變化。 實(shí)驗(yàn)分為Bax/Bak WT對(duì)照組、Bax/Bak WT運(yùn)動(dòng)組、Bax/Bak DKO對(duì)照組、Bax/BakDKO運(yùn)動(dòng)組。Western Blot方法檢測(cè)不同線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá),放射性同位素35S標(biāo)記示蹤法檢測(cè)線(xiàn)粒體PIM功能。 結(jié)果： 1.急性電刺激肌細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ROS/Ca2+/AMPK/p38MAPK等分子／激酶信號(hào)通路,使PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄活性與輔激活轉(zhuǎn)錄活性各顯著增高52%、35%,為其參與調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)提供基礎(chǔ)。 2. PGC-1α基因缺失對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)的影響呈現(xiàn)多樣性,對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體PIM功能無(wú)顯著影響。 3. PGC-1α基因缺失造成的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境使骨骼肌線(xiàn)粒體OCT輸入率顯著降低44%-57%。 4. Bax/Bak基因缺失使凋亡誘導(dǎo)因素刺激下的SS線(xiàn)粒體、IMF線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C釋放量各顯著降低64%、70%,其在參與線(xiàn)粒體途徑促細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 5. Bax/Bak基因缺失導(dǎo)致線(xiàn)粒體基礎(chǔ)態(tài)、態(tài)IV膜電位各顯著降低20%和16%,并使線(xiàn)粒體融裂蛋白表達(dá)發(fā)生變化。 6. Bax/Bak基因缺失使骨骼肌線(xiàn)粒體PIM組件蛋白Tom40、mtHsp60以及mtHsp70表達(dá)水平均顯著降低38%至40%,卻使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)應(yīng)激蛋白Hsp90、Bip表達(dá)水平異常顯著增高,導(dǎo)致線(xiàn)粒體OCT、TomO蛋白輸入率分別顯著降低37%與41%,線(xiàn)粒體基質(zhì)、外膜蛋白輸入通路功能?chē)?yán)重受損。 7.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練上調(diào)線(xiàn)粒體PIM關(guān)鍵組件蛋白Tom40蛋白表達(dá),優(yōu)化細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激蛋白表達(dá)水平,使受損的線(xiàn)粒體PIM功能恢復(fù)至正常水平。 結(jié)論： 1. Ca2+、ROS、AMPK、p38等細(xì)胞分子/激酶信號(hào)通路參與電刺激誘導(dǎo)的PGC-1α轉(zhuǎn)錄水平及翻譯后蛋白水平基因調(diào)控,是PGC-1α在急性應(yīng)激條件下作用于線(xiàn)粒體PIM組件基因的分子基礎(chǔ)。 2. PGC-la基因?qū)趋兰【�(xiàn)粒體PIM的調(diào)控并非作用于對(duì)TOM、TIM組件蛋白基因的調(diào)控,而通過(guò)對(duì)細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體基質(zhì)相關(guān)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)、未折疊蛋白反應(yīng)(UPR, unfolded protein response)基因的調(diào)控。 3)促細(xì)胞凋亡因子Bax/Bak基因除具有促細(xì)胞凋亡特性外,還具備許多潛在的非促細(xì)胞凋亡特性,具體表現(xiàn)在維持線(xiàn)粒體膜電位、參與調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體融裂以及支持骨骼肌線(xiàn)粒體PIM等方面。 4) Bax/Bak基因?qū)趋兰【�(xiàn)粒體基質(zhì)蛋白(OCT)、線(xiàn)粒體外膜蛋白(Tom40)輸入通路均具有重要作用,其主要通過(guò)對(duì)PIM組件蛋白表達(dá)、線(xiàn)粒體膜電位、PIM相關(guān)伴侶蛋白表達(dá)的影響得以實(shí)現(xiàn)。 5)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)Bax/Bak雙基因敲除鼠受損線(xiàn)粒體蛋白輸入功能具有正向調(diào)節(jié)的作用,這一作用伴隨線(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性上調(diào)、細(xì)胞質(zhì)中應(yīng)激蛋白表達(dá)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性?xún)?yōu)化。提示：骨骼肌線(xiàn)粒體PIM具有運(yùn)動(dòng)可塑性,且線(xiàn)粒體PIM與細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)、未折疊蛋白反應(yīng)(UPR, unfolded protein response)、線(xiàn)粒體應(yīng)激等生理過(guò)程密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：骨骼肌 線(xiàn)粒體PIM PIM組件蛋白 PIM功能 PGC-1α Bax/Bak 急性電刺激 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 C2C12肌細(xì)胞 基因敲除鼠
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：G804.2
【目錄】：

• 論文摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-47
• 第一章 線(xiàn)粒體蛋白輸入機(jī)制(PIM)14-28
• 前言14
• 第一節(jié) 線(xiàn)粒體PIM概述14-15
• 第二節(jié) 線(xiàn)粒體PIM與線(xiàn)粒體生物發(fā)生15-16
• 第三節(jié) 線(xiàn)粒體PIM主要通路及重要組件16-22
• 第四節(jié) 線(xiàn)粒體PIM與相關(guān)疾病22-24
• 第五節(jié) 影響線(xiàn)粒體PIM功能的主要因素24-26
• 第六節(jié) 線(xiàn)粒體PIM研究展望26-28
• 第二章 PGC-1α與線(xiàn)粒體PIM28-36
• 前言28
• 第一節(jié) PGC-1α基因概述28-29
• 第二節(jié) PGC-1α基因調(diào)控29-31
• 第三節(jié) PGC-1α與運(yùn)動(dòng)性線(xiàn)粒體生物發(fā)生31-35
• 第四節(jié) PGC-1α與線(xiàn)粒體PIM組件蛋白35-36
• 第三章 Bax/Bak與線(xiàn)粒體PIM36-47
• 前言36
• 第一節(jié) Bax/Bak基因概述36-43
• 第二節(jié) Bax/Bak的促凋亡特性43-44
• 第三節(jié) Bax/Bak與線(xiàn)粒體PIM的聯(lián)系44-47
• 第二篇 研究報(bào)告47-147
• 第一章 PGC-1α對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體PIM作用機(jī)制研究47-105
• 前言47
• 第一節(jié) 急性電刺激對(duì)肌細(xì)胞PGC-1α基因調(diào)控機(jī)制研究47-85
• 1. 急性電刺激誘導(dǎo)下的細(xì)胞內(nèi)分子、激酶信號(hào)通路研究48-59
• 2. 急性電刺激誘導(dǎo)肌細(xì)胞PGC-1α轉(zhuǎn)錄活性研究59-70
• 3. 急性電刺激誘導(dǎo)肌細(xì)胞PGC-1α輔激活轉(zhuǎn)錄活性研究70-84
• 4. 小結(jié)84-85
• 第二節(jié) PGC-1α對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體PIM的影響85-104
• 1. PGC-1α對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體PIM主要組件蛋白表達(dá)的影響85-95
• 2. PGC-1α對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體基質(zhì)蛋白輸入功能的影響95-103
• 3. 小結(jié)103-104
• 本章小結(jié)104-105
• 第二章 Bak/Bak對(duì)骨骼肌線(xiàn)粒體PIM作用機(jī)制研究105-147
• 前言105
• 第一節(jié) Bak/Bak基因基礎(chǔ)性研究105-115
• 1. Bak/Bak促細(xì)胞凋亡特性研究106-110
• 2. Bak/Bak潛在的非促細(xì)胞凋亡特性研究110-115
• 3. 小結(jié)115
• 第二節(jié) Bak/Bak基因?qū)趋兰【�(xiàn)粒體PIM的影響115-129
• 1. Bak/Bak基因?qū)趋兰【�(xiàn)粒體PIM組件蛋白表達(dá)的影響115-121
• 2. Bak/Bak基因?qū)趋兰【�(xiàn)粒體PIM功能的影響121-129
• 3. 小結(jié)129
• 第三節(jié) 線(xiàn)粒體PIM的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性研究129-145
• 1. 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)Bak/Bak WT與DKO鼠基礎(chǔ)指標(biāo)的影響130-136
• 2. 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)Bak/Bak WT與DKO鼠骨骼肌線(xiàn)粒體PIM的影響136-145
• 3. 小結(jié)145
• 本章小結(jié)145-147
• 第三篇 研究總結(jié)147-151
• 1. 研究結(jié)論147-148
• 2. 創(chuàng)新之處148
• 3. 缺陷與不足148-149
• 4. 研究展望149-151
• 備注151-152
• 附錄152-169
• 參考文獻(xiàn)169-186
• 后記186

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張桂忠;姜寧;張勇;;急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激機(jī)制研究[J];內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)漢文版);2009年03期

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6 汶希;潘華山;馮毅，

本文編號(hào)：921665