本文關(guān)鍵詞：玉米轉(zhuǎn)錄因子Opaque2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與19-kDa α-醇溶蛋白基因的DNA甲基化研究

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【摘要】：玉米(maize, Zea mays)是世界上最重要的糧食作物之一,玉米的籽粒是營養(yǎng)儲(chǔ)藏的重要器官,在種子總蛋白中,種子儲(chǔ)藏蛋白(seed storage proteins, SSP)約占總蛋白含量的70%,其中的醇溶蛋白又是玉米種子儲(chǔ)藏蛋白中最重要的蛋白,約占70%。然而由于醇溶蛋白特別是α-醇溶蛋白的必需氨基酸含量較低,影響了玉米的營養(yǎng)價(jià)值。而轉(zhuǎn)錄因子Opaque2(02)能結(jié)合22-kDa的α-醇溶蛋白基因啟動(dòng)子上的TCCACGTAGA模體序列調(diào)控其表達(dá),02基因的突變能降低α-醇溶蛋白的含量,提高含必需氨基酸蛋白的含量,從而提高玉米的營養(yǎng)價(jià)值。此外,02還能通過結(jié)合核糖體失活蛋白(Ribosome-Inactivating Proteins, RIP)基因啟動(dòng)子上的GATGAPyPuTGPu模體調(diào)控其表達(dá)。本研究利用生物信息學(xué)的方法,在玉米全基因組范圍內(nèi)搜索潛在的02所調(diào)控基因；結(jié)合雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù),分析W64A及其02突變體W64Ao2的差異蛋白,尋找02基因所調(diào)控的蛋白；并對(duì)19-kDa的α-醇溶蛋白基因啟動(dòng)子及其本體的DNA甲基化進(jìn)行分析,探究19-kDa和22-kDa的α-醇溶蛋白基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,主要研究結(jié)果如下： 1、在玉米全基因組范圍內(nèi)搜索到31個(gè)啟動(dòng)子上含TCCACGTAGA模體的基因,其中有8個(gè)是串聯(lián)重復(fù)的22-kDa的α-醇溶蛋白基因。GO分析顯示這8個(gè)α-醇溶蛋白基因參與營養(yǎng)儲(chǔ)藏功能,其他基因主要是參與催化活性的酶類編碼基因。而含有GATGAPyPuTGPu模體序列的基因有683個(gè),其中197個(gè)基因有功能注釋,GO分析顯示這些基因參與最多的是結(jié)合、催化活性和細(xì)胞組分,并且多數(shù)參與核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸及糖類等物質(zhì)的代謝催化反應(yīng),另外還有部分轉(zhuǎn)錄因子。組織表達(dá)分析顯示共有12個(gè)基因在胚乳中特異性表達(dá),其中8個(gè)是22-kDa的α-醇溶蛋白基因,另外4個(gè)是含有GATGAPyPuTGPu模體序列的基因,其中包括直接受02調(diào)控的RIP基因。 2、通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)共鑒定到W64A及其02突變體間的19個(gè)差異蛋白,GO分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要是參與催化和代謝相關(guān)酶類,以及參與細(xì)胞組成和應(yīng)激相關(guān)。組織表達(dá)分析表明6個(gè)為種子中特異性高表達(dá)的蛋白,分別是與種子儲(chǔ)藏相關(guān)的蛋白、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)和直接受02基因調(diào)控的RIP蛋白。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有5個(gè)基因在野生型與突變體中的轉(zhuǎn)錄水平差異較大。 3、對(duì)19-kDa的α-醇溶蛋白基因啟動(dòng)子的DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的高甲基化能抑制醇溶蛋白基因的表達(dá),而組織培養(yǎng)能改變基因啟動(dòng)子上的DNA甲基化狀態(tài),從而改變基因的表達(dá)水平,而且組織培養(yǎng)對(duì)不同基因的DNA甲基化的影響不同,既能降低又能升高DNA甲基化水平。在z1B基因中,zlBl的啟動(dòng)子DNA甲基化水平降低而使其表達(dá)水平顯著上升,而z1B4和z1B6的啟動(dòng)子DNA甲基化水平升高而使其表達(dá)水平顯著下降。但z1A基因啟動(dòng)子DNA甲基化的變化對(duì)基因的表達(dá)幾乎沒有影響,表現(xiàn)出位點(diǎn)特異性。相比啟動(dòng)子而言,基因本體的DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響要小得多。分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的z1A2-1和z1B4基因其本體的DNA甲基化都處于中等的水平(25-30%),而低或不表達(dá)的基因的本體DNA甲基化都過高或高低。
【關(guān)鍵詞】：玉米 醇溶蛋白 Opaque2 雙向電泳 DNA甲基化 基因本體
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S513
【目錄】：

• 致謝6-10
• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-36
• 1.1 玉米醇溶蛋白14-25
• 1.1.1 玉米醇溶蛋白的分類及基因分布14-15
• 1.1.2 玉米醇溶蛋白的表達(dá)15-17
• 1.1.3 玉米醇溶蛋白的表達(dá)調(diào)控17-25
• 1.2 DNA的甲基化25-31
• 1.2.1 DNA甲基化的建立和維持25
• 1.2.2 DNA甲基化的分類及功能25-29
• 1.2.3 DNA甲基化的檢測(cè)方法29-31
• 1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究31-33
• 1.3.1 雙向電泳31-32
• 1.3.2 質(zhì)譜技術(shù)32
• 1.3.3 同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量法(iTRAQ)32
• 1.3.4 植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究32-33
• 1.4 本課題研究的目的、意義及主要內(nèi)容33-36
• 1.4.1 研究目的和意義33-34
• 1.4.2 本研究的主要內(nèi)容34-36
• 第二章 玉米Opaque2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基因的全基因組分析36-52
• 2.1 前言36-37
• 2.2 材料與方法37-38
• 2.2.1 數(shù)據(jù)來源37
• 2.2.2 O2蛋白所結(jié)合的基因預(yù)測(cè)流程37-38
• 2.2.3 染色體分布及GO(Gene Ontology)分析38
• 2.2.4 組織表達(dá)分析38
• 2.3 結(jié)果與分析38-49
• 2.3.1 啟動(dòng)子中含TCCACGTAGA模體序列基因的鑒定與分析38-41
• 2.3.2 啟動(dòng)子中含TCCACGTAGA模體序列基因的GO分析41-42
• 2.3.3 啟動(dòng)子中含TCCACGTAGA模體序列基因的組織表達(dá)分析42-44
• 2.3.4 啟動(dòng)子中含GATGAPyPuTGPu模體序列的基因鑒定與分析44
• 2.3.5 啟動(dòng)子中含GATGAPyPuTGPu模體序列基因的GO分析44-47
• 2.3.6 含GATGAPyPuTGPu模體序列的基因組織表達(dá)分析47-49
• 2.4 討論49-51
• 2.5 小結(jié)51-52
• 第三章 玉米野生型Opaque2及其突變體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析52-72
• 3.1 前言52-53
• 3.2 材料和方法53-57
• 3.2.1 材料53
• 3.2.2 玉米種子總蛋白的提取及測(cè)定53-54
• 3.2.3 雙向電泳54-56
• 3.2.4 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)分析56-57
• 3.2.5 RT-PCR檢測(cè)57
• 3.3 結(jié)果與分析57-67
• 3.3.1 種子總蛋白的雙向電泳及質(zhì)譜鑒定57-63
• 3.3.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果的GO分析63-64
• 3.3.3 差異蛋白點(diǎn)的組織表達(dá)分析64-65
• 3.3.4 RT-PCR分析65-67
• 3.4 討論67-69
• 3.4.1 種子中其他形式的貯藏蛋白67-68
• 3.4.2 O2基因的突變改變了種子中酶活性相關(guān)蛋白的表達(dá)68-69
• 3.5 小結(jié)69-72
• 第四章 玉米19-kDa α-醇溶蛋白基因的DNA甲基化研究72-90
• 4.1 前言72-74
• 4.2 材料和方法74-77
• 4.2.1 材料74
• 4.2.2 方法74-77
• 4.3 結(jié)果與分析77-86
• 4.3.1 19-kDa α-醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子呈現(xiàn)DNA甲基化多樣性77-78
• 4.3.2 組織培養(yǎng)能誘導(dǎo)特異位點(diǎn)的DNA甲基化78-81
• 4.3.3 基因本體的DNA甲基化分析81-84
• 4.3.4 CCG的甲基化84-86
• 4.4 討論86-88
• 4.4.1 組織培養(yǎng)改變基因的甲基化86-87
• 4.4.2 中等的基因本體甲基化水平更有利于基因的表達(dá)87
• 4.4.3 mCCG的甲基化受到抑制87-88
• 4.5 小結(jié)88-90
• 第五章 總結(jié)與展望90-92
• 5.1 總結(jié)90-91
• 5.2 展望91-92
• 參考文獻(xiàn)92-108
• 附錄108-109

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：754316