本文關(guān)鍵詞：葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系與轉(zhuǎn)抗病相關(guān)基因研究

  更多相關(guān)文章： 葡萄 白粉病 抗病基因 遺傳轉(zhuǎn)化 抗病育種

【摘要】：歐洲葡萄品種(Vitis vinifera L.)品質(zhì)優(yōu)良、被廣泛栽培在世界廣大地區(qū),其主要缺點是抗病性差;改良優(yōu)質(zhì)歐洲葡萄品種抗病性成為葡萄抗病育種的目標(biāo)之一。遺傳工程轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)是定向改良葡萄抗病性快捷途徑之一。本研究以釀酒葡萄品種霞多麗(V.vinifera cv.Chardonnay)、梅鹿特(V.vinifera cv.Merlot)、赤霞珠(V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon)、品麗珠(V.vinifera cv.Cabernet Franc)、鮮食葡萄品種紅地球(V.vinifera cv.Red Globe)為材料,建立并優(yōu)化葡萄體細(xì)胞胚發(fā)生途徑。在此再生途徑的基礎(chǔ)上,建立葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系,將課題組前期從抗白粉病的華東葡萄白河葡萄-35-1中克隆的抗白粉病相關(guān)基因芪合成酶基因Vp STSg DNA2、泛素連接酶基因Vp UR9、病程相關(guān)蛋白基因Vp PR4-1,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化至感病的歐洲葡萄品種中,研究基因的抗病功能,為改良?xì)W洲葡萄品種抗病性提供依據(jù)。本研究取得的主要結(jié)果如下:1.體細(xì)胞胚再生途徑建立:霞多麗、梅鹿特、品麗珠、赤霞珠的花蕾在胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS1、PIV、MC)上能夠誘導(dǎo)出胚性愈傷組織(Embryogenic callus,EC),基因型影響胚性愈傷誘導(dǎo)率,其中霞多麗、梅鹿特的平均胚性愈傷誘導(dǎo)效率分別為12.00%和9.05%,高于品麗珠(0.03%)、赤霞珠(0.83%)。三種胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,PIV培養(yǎng)基適于多種基因型葡萄胚性愈傷誘導(dǎo)。霞多麗、品麗珠、赤霞珠適宜在PIV培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷,其誘導(dǎo)率分別為13.8、0.1和1.3%;梅鹿特在MC培養(yǎng)基上胚性愈傷誘導(dǎo)效率較好,為12.1%。添加毒莠定能提高霞多麗胚性愈傷誘導(dǎo)效率。霞多麗小花蕾在2.0mg L-16-BA、0.5mg L-12,4-D、3.0mg L-1毒莠定的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效率提高至16.4%。梅鹿特和實驗室前期誘導(dǎo)的紅地球葡萄的胚性愈傷在X6培養(yǎng)基上能夠保持和擴繁,霞多麗適宜的胚性保持和擴繁培養(yǎng)基是添加2mg L-1毒莠定的MS培養(yǎng)基。梅鹿特和紅地球體細(xì)胞胚(Somatic embryo,SE)在添加0.2mg L-16-BA的MS培養(yǎng)基成苗數(shù)分別為57、63株/0.1g原胚團(tuán)(Proembryonic masses,PEM)。而霞多麗葡萄在此培養(yǎng)基上成苗數(shù)為18株/0.1g PEM,通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分,霞多麗適宜的體細(xì)胞胚萌發(fā)成苗培養(yǎng)基是0.2mg L-1KT、0.1mg L-1NOA的MS培養(yǎng)基。2.遺傳轉(zhuǎn)化方法比較與獲得轉(zhuǎn)芪合成酶基因葡萄植株:利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍轉(zhuǎn)化方法,將葡萄糖醛酸酶基因(β-glucuronidase,GUS)轉(zhuǎn)入霞多麗PEM中,并對抗性的體胚進(jìn)行GUS染色,結(jié)果表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獲得的抗性體細(xì)胞胚中GUS表達(dá)量高于基因槍遺傳轉(zhuǎn)化法。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將芪合成酶基因Vp STSg DNA2轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種霞多麗、梅鹿特、紅地球的胚性愈傷、原胚團(tuán)、體細(xì)胞胚三種類型的胚性材料中,結(jié)果表明不同胚性材料的轉(zhuǎn)化效率不同。胚性愈傷和體細(xì)胞胚在篩選過程中褐化、不能恢復(fù),原胚團(tuán)在篩選過程中再生形成抗性材料,因此原胚團(tuán)為葡萄的適宜的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料�；蛐陀绊懺邎F(tuán)的恢復(fù)與再生,試驗中分別獲得69、3、2株霞多麗、梅鹿特、紅地球的抗性株系。PCR檢測結(jié)果表明,32株霞多麗抗性株系為陽性株系,其余葡萄未檢測到目的片段。3.轉(zhuǎn)芪合成酶基因Vp STSg DNA2葡萄植株分子檢測:轉(zhuǎn)白河-35-1中芪合成酶基因Vp STSg DNA2的霞多麗葉片接種白粉菌[Uncinula necator(Schw.)Burr.]表明,轉(zhuǎn)芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多麗葉片中Vp STSg DNA2受白粉菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄;在Vp STSg DNA2轉(zhuǎn)錄的同時,查爾酮合成酶基因轉(zhuǎn)錄受抑制,Vp STSg DNA2的產(chǎn)物反式白藜蘆醇和ε-葡萄素含量的增加。同時,轉(zhuǎn)芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多麗葡萄葉片中有H2O2的積累。轉(zhuǎn)芪合成酶基因Vp STSg DNA2霞多麗葡萄葉片上的白粉菌菌絲密度低于對照霞多麗葡萄葉片。初步表明,歐洲葡萄品種霞多麗轉(zhuǎn)入Vp STSg DNA2基因的植株能夠抑制白粉菌菌絲的生長、提高轉(zhuǎn)基因植株對白粉菌的抗病能力。4.獲得轉(zhuǎn)泛素連接酶基因Vp UR9葡萄植株與分子檢測:利用同源克隆方法,分離獲得華東葡萄白河-35-1泛素連接酶基因Vp UR9,經(jīng)預(yù)測分析,該基因編碼164個氨基酸,具有保守RING結(jié)構(gòu)域,該基因轉(zhuǎn)錄受白粉菌和水楊酸調(diào)控。構(gòu)建該基因植物表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入歐洲葡萄品種霞多麗、梅鹿特、紅地球中過量表達(dá)。通過篩選得到15個轉(zhuǎn)化泛素連接酶基因Vp UR9紅地球株系,對FLAG-tag進(jìn)行western blotting檢測,其陽性率為80%,其余葡萄未獲得陽性植株,Kan抗性適宜紅地球葡萄的轉(zhuǎn)化及篩選。接種白粉菌結(jié)果表明,轉(zhuǎn)泛素連接酶基因Vp UR9的紅地球?qū)Π追劬目剐詼p弱。5.獲得轉(zhuǎn)病程相關(guān)蛋白基因Vp PR4-1葡萄植株與分子檢測:利用同源克隆方法,分離獲得華東葡萄白河-35-1中的病程相關(guān)蛋白基因Vp PR4-1。經(jīng)預(yù)測分析,該基因編碼143個氨基酸,其轉(zhuǎn)錄受白粉菌、水楊酸、茉莉酸甲酯調(diào)控。Vp PR4-1蛋白具有DNase活性,該蛋白定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜上。構(gòu)建病程相關(guān)蛋白基因Vp PR4-1過量植物表達(dá)載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入歐洲葡萄品種紅地球中。最終得到30株紅地球轉(zhuǎn)化病程相關(guān)蛋白基因Vp PR4-1的紅地球植株,對Vp PR4-1進(jìn)行western blotting檢測,其中26個株系Vp PR4-1蛋白表達(dá)量升高。通過白粉菌接種及觀察,初步認(rèn)為轉(zhuǎn)化病程相關(guān)蛋白基因Vp PR4-1的紅地球葡萄對白粉菌的抗性增強。綜上,歐洲葡萄品種轉(zhuǎn)入中國野生葡萄抗病基因是可行的,這為定向改良與提高栽培的歐洲葡萄品種的抗病性提供了依據(jù);下一步研究重點是優(yōu)化調(diào)節(jié)胚性愈傷組織擴繁方法,延長胚性材料的保存方法與增殖效率;提高轉(zhuǎn)基因效率;促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育,按照科學(xué)程序,進(jìn)入田間觀察開花結(jié)果,為這項研究的應(yīng)用提供有價值的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：葡萄 白粉病 抗病基因 遺傳轉(zhuǎn)化 抗病育種
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S663.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• 英文摘要8-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-25
• 1.1 葡萄遺傳轉(zhuǎn)化研究簡介15-20
• 1.1.1 葡萄再生途徑16-19
• 1.1.2 葡萄遺傳轉(zhuǎn)化方法19-20
• 1.1.3 轉(zhuǎn)基因葡萄植株的篩選20
• 1.2 葡萄抗白粉病研究簡介20-21
• 1.2.1 葡萄白粉病20-21
• 1.2.2 葡萄抗白粉病簡介21
• 1.3 葡萄3個抗白粉病基因的研究簡介21-24
• 1.3.1 葡萄抗白粉病芪合成酶基因21-22
• 1.3.2 葡萄抗白粉病泛素連接酶基因22-23
• 1.3.3 葡萄抗白粉病病程相關(guān)蛋白基因23-24
• 1.4 本研究的目的和意義24-25
• 第二章 歐洲葡萄品種體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的建立及轉(zhuǎn)基因方法篩選25-40
• 2.1 材料和試劑25-26
• 2.1.1 供試葡萄植物材料25
• 2.1.2 供試植物表達(dá)載體及菌株25
• 2.1.3 主要試劑25-26
• 2.1.4 主要儀器26
• 2.2 方法26-29
• 2.2.1 葡萄品種器官發(fā)生途徑的建立26
• 2.2.2 葡萄品種體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的建立26-27
• 2.2.3 葡萄品種體細(xì)胞胚發(fā)育各個時期的形態(tài)學(xué)觀察27
• 2.2.4 葡萄品種農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍法轉(zhuǎn)基因效率的比較27-28
• 2.2.5 數(shù)據(jù)分析28-29
• 2.3 結(jié)果與分析29-37
• 2.3.1 葡萄品種器官發(fā)生途徑的建立29
• 2.3.2 歐洲葡萄品種胚性愈傷組織的誘導(dǎo)的影響因素29-33
• 2.3.3 葡萄品種胚性愈傷組織的保持與擴繁培養(yǎng)基的篩選33-34
• 2.3.4 葡萄品種體細(xì)胞胚的萌發(fā)與成苗培養(yǎng)基篩選34-36
• 2.3.5 葡萄品種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法轉(zhuǎn)基因GUS染色結(jié)果比較36-37
• 2.4 討論37-39
• 2.5 小結(jié)39-40
• 第三章 歐洲葡萄品種遺傳轉(zhuǎn)化體系建立與轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 芪合成酶基因研究 .. 2640-53
• 3.1 材料和試劑40-41
• 3.1.1 供試葡萄植物材料40
• 3.1.2 供試植物表達(dá)載體及菌株40
• 3.1.3 葡萄白粉菌40-41
• 3.1.4 主要試劑41
• 3.1.5 主要儀器41
• 3.2 方法41-43
• 3.2.1 華東葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種41-42
• 3.2.2 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的歐洲葡萄抗性植株檢測42
• 3.2.3 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的歐洲葡萄品種植株接種白粉菌及H2O2檢測42
• 3.2.4 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的歐洲葡萄品種植株接種白粉菌目的基因轉(zhuǎn)錄水平檢測42-43
• 3.2.5 轉(zhuǎn)化芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的歐洲葡萄植株接種白粉菌芪類物質(zhì)的HPLC檢測43
• 3.2.6 數(shù)據(jù)分析43
• 3.3 結(jié)果與分析43-50
• 3.3.1 歐洲葡萄品種轉(zhuǎn)化華東葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 與抗性植株分子檢測43-46
• 3.3.2 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的歐洲葡萄品種霞多麗葉片接種白粉菌及H2O2檢測46-48
• 3.3.3 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的歐洲葡萄品種霞多麗葡萄葉片接種白粉菌目的基因轉(zhuǎn)錄水平檢測48-50
• 3.3.4 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 芪合成酶基因VpSTSgDNA2 的霞多麗葡萄葉片接種白粉菌芪類物質(zhì)的HPLC檢測50
• 3.4 討論50-52
• 3.5 小結(jié)52-53
• 第四章 華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種的研究53-67
• 4.1 材料和試劑53-54
• 4.1.1 供試葡萄植物材料53
• 4.1.2 供試植物表達(dá)載體及菌株53
• 4.1.3 主要試劑53-54
• 4.1.4 主要儀器54
• 4.2 方法54-56
• 4.2.1 華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 序列比對與聚類分析54
• 4.2.2 華東葡萄白河351 和歐洲葡萄品種黑比諾葉片在白粉菌、水楊酸處理時泛素連接酶基因VpUR9 的轉(zhuǎn)錄變化54
• 4.2.3 華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 構(gòu)建植物過量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種54-55
• 4.2.4 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 歐洲葡萄品種抗性植株的分子檢測55
• 4.2.5 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 歐洲葡萄品種抗性植株的western blotting檢測55
• 4.2.6 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 歐洲葡萄品種植株的白粉病抗性檢測55
• 4.2.7 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 歐洲葡萄品種植株的抗病相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)量分析55-56
• 4.3 結(jié)果與分析56-65
• 4.3.1 華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 序列分析與相近物種序列比對及聚類分析56-58
• 4.3.2 華東葡萄白河351 及歐洲葡萄品種黑比諾中泛素連接酶基因VpUR9 對白粉菌和水楊酸的響應(yīng)58-59
• 4.3.3 華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種59-61
• 4.3.4 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 歐洲葡萄品種紅地球抗性植株的分子檢測及western blotting61-62
• 4.3.5 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 歐洲葡萄品種紅地球的白粉病抗性檢測62-64
• 4.3.6 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 泛素連接酶基因VpUR9 對歐洲葡萄品種紅地球葡萄植株抗病相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)的影響64-65
• 4.4 討論65-66
• 4.5 小結(jié)66-67
• 第五章 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種紅地球的研究67-80
• 5.1 材料和試劑67-68
• 5.1.1 供試植物材料67
• 5.1.2 供試植物表達(dá)載體及菌株67
• 5.1.3 主要試劑67-68
• 5.1.4 主要儀器68
• 5.2 方法68-69
• 5.2.1 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 序列比對與聚類分析68
• 5.2.2 華東葡萄白河351 白粉菌侵染、外源激素噴施、逆境脅迫下病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 表達(dá)分析68
• 5.2.3 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 克隆、亞細(xì)胞定位與VpPR4-1蛋白的DNase活性分析68-69
• 5.2.4 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種紅地球69
• 5.2.5 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 歐洲葡萄品種紅地球白粉菌抗性鑒定與抗病相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)定量分析69
• 5.3 結(jié)果與分析69-78
• 5.3.1 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 序列比對與聚類分析69-71
• 5.3.2 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 對白粉菌、外源激素及逆境脅迫的響應(yīng)71-73
• 5.3.3 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白VpPR4-1 的DNase活性分析73
• 5.3.4 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 亞細(xì)胞定位73-74
• 5.3.5 華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種紅地球74-76
• 5.3.6 轉(zhuǎn)華東葡萄白河351 病程相關(guān)蛋白基因VpPR4-1 歐洲葡萄品種紅地球白粉菌抗性鑒定與抗病相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)分析76-78
• 5.4 討論78-79
• 5.5 小結(jié)79-80
• 第六章 結(jié)論80-81
• 參考文獻(xiàn)81-94
• 縮略詞94-95
• 致謝95-96
• 作者簡介96

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 潘學(xué)軍;李順雨;張文娥;劉崇懷;;‘森田尼無核’葡萄胚發(fā)育及敗育的細(xì)胞學(xué)特征[J];北方園藝;2011年05期

2 張今今,王躍進(jìn),王西平,楊克強,楊進(jìn)孝;葡萄總RNA提取方法的研究[J];果樹學(xué)報;2003年03期

3 鞏鵬濤;黃東杰;黃昭奮;;中國轉(zhuǎn)基因作物,機遇與挑戰(zhàn)[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2009年02期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 朱自果;中國野生華東葡萄cDNA文庫測序及轉(zhuǎn)錄因子基因ERF和NAC功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 譚超;歐洲葡萄體胚誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)化中國野葡萄芪合成酶基因的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

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本文編號：755591