發(fā)布時間：2017-07-20 02:00

  本文關鍵詞：高致病性PRRSV誘導仔豬胸腺的損傷機制及PRRSV抗獨特型抗體的免疫調控

  更多相關文章： 豬繁殖與呼吸綜合征 胸腺 自噬 凋亡 抗獨特型抗體 單鏈抗體

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。該病在臨床上主要引起母豬流產、死胎或木乃伊胎,并引起育肥豬和仔豬的呼吸障礙。1987年,美國首先報道該病,1996年我國首次分離并報道該病。PRRSV為單股正鏈(+)RNA病毒,歸類于動脈炎病毒科,動脈炎病毒屬。2006年5月,高致病性PRRS(HP-PRRS)從我國南方地區(qū)開始爆發(fā),主要表現(xiàn)為發(fā)病豬群的“三高”,即體溫高、發(fā)病率高、死亡率高,HP-PRRS的爆發(fā)導致我國養(yǎng)豬業(yè)損失巨大。許多研究表明,PRRSV變異毒株對中樞及外周免疫器官的噬性顯著增強,除能引起胸腺嚴重萎縮外,還能導致外周免疫器的出血、壞死、淋巴細胞嚴重減少并伴隨細胞凋亡現(xiàn)象。目前,PRRS/HP-PRRS的防控仍然是獸醫(yī)病毒學及免疫學界的難題,感染宿主對PRRSV/HP-PRRSV的免疫應答仍不清楚。PRRSV/HP-PRRSV感染豬抗體產生較早且抗體滴度較高,但早期產生的抗體難以保護機體免受病毒的感染,甚至發(fā)揮抗體依賴性增強作用幫助病毒對機體造成更嚴重的傷害。本課題在前期研究的基礎上,進一步研究HP-PRRSV感染誘導仔豬胸腺內自噬與凋亡情況,探討HP-PRRSV對仔豬胸腺的損傷機制;研究PRRSV經典及變異毒株弱毒疫苗抗HP-PRRSV的作用機理;通過使用PRRSV GP5的抗獨特型抗體調控機體的免疫網絡,研究PRRSV感染與機體免疫網絡的關系;探索PRRSV單克隆抗獨特型單鏈抗體的免疫生物學功能。為進一步研究機體對PRRSV的免疫反應機制及免疫調控機制奠定基礎。1、PRRSV感染引起胸腺內細胞的自噬和凋亡的研究細胞死亡是被周密調控的一系列復雜過程。凋亡,是一種程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)方式,用于維持機體自身平衡和內環(huán)境穩(wěn)定,該過程受基因嚴格調控。自噬,也是程序性細胞死亡的一種方式,它是將受損的細胞器及大分子物質依賴溶酶體降解供機體重新利用的過程。很多疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中,細胞凋亡與細胞自噬并存,它們在調控細胞死亡的過程中通路相互關聯(lián),互為調控。胸腺作為哺乳動物的中樞免疫器官之一,既介導細胞免疫,又為T細胞分化、發(fā)育提供場所。PRRSV感染可造成體內及體外培養(yǎng)細胞的凋亡及體外感染細胞的自噬現(xiàn)象,然而,HP-PRRSV感染引起仔豬胸腺萎縮,在萎縮的胸腺內細胞自噬情況未見相關報道。本實驗目的是通過流式細胞技術、Western blot技術,研究HP-PRRSV感染仔豬胸腺誘導胸腺細胞的自噬與凋亡情況;通過免疫熒光共聚焦技術,闡明HP-PRRSV感染仔豬胸腺內病毒感染細胞、凋亡細胞與自噬細胞的關系,鑒定發(fā)生自噬細胞的類型。實驗結果顯示:HP-PRRSV感染仔豬的胸腺內,既存在細胞自噬現(xiàn)象,也存在細胞凋亡現(xiàn)象;自噬既可發(fā)生于病毒感染的細胞,也發(fā)生于病毒未感染細胞;發(fā)生自噬的細胞為CD14+細胞及胸腺上皮細胞,而占有胸腺中細胞總數(shù)85-90%的T細胞沒有發(fā)生自噬,而發(fā)生了凋亡。2、PRRSV不同毒株弱毒疫苗對HP-PRRSV免疫保護作用的研究自2006年HP-PRRS在我國爆發(fā)以來,PRRSV疫苗在豬場中普遍使用。然而,由于PRRSV的免疫機制目前尚不清晰,PRRSV疫苗的選擇及使用尚存在很大的爭議。目前臨床上流行的毒株以變異毒株為主,但經典PRRSV弱毒疫苗在使用中安全性較高,并對HP-PRRSV有交叉保護性,在臨床上也被廣泛使用。因此,本實驗選用PRRSV經典株弱毒疫苗CH-1R株及變異毒株弱毒疫苗Hu N4-F112毒株免疫斷奶仔豬,使用變異毒株HP-PRRSV Hu N4攻毒后,通過觀察臨床癥狀、病理組織學變化,檢測血清中病毒載量、細胞免疫及體液免疫的變化,探討不同毒株弱毒疫苗對變異毒株的免疫保護作用。實驗結果顯示:CH-1R、Hu N4 F112免疫的仔豬均有效的抵御HP-PRRSV的感染,二者在臨床癥狀、眼觀剖檢變化、肺臟及胸腺的病理變化都明顯優(yōu)于HP-PRRSV攻毒組。然而,同Hu N4 F112免疫組相比,CH-1R組在疫苗免疫期膜蛋白抗體水平及HP-PRRSV感染后血清病毒載量都存在明顯差異。PRRSV誘導機體產生的中和抗體主要是以膜蛋白抗體為主,Hu N4 F112免疫豬血清中的中和抗體在體外能有效阻止HP-PRRSV感染Marc-145細胞。本研究中,CH-1R免疫組與Hu N4 F112感染組在攻毒后血清病毒載量差異是否與同源毒株產生的中和抗體有關需進一步研究。3、PRRSV GP5抗獨特型抗體影響PRRSV弱毒疫苗的使用效果我們前期研究發(fā)現(xiàn),感染了PRRSV的豬體內可產生兩種不同的針對GP5的抗獨特型抗體,這兩種抗獨特型抗體可影響PRRSV感染豬的帶毒狀態(tài)。本實驗目的是使用PRRSV GP5抗獨特型抗體對機體進行免疫調控,觀察抗獨特型抗體對PRRSV弱毒疫苗的使用效果。實驗豬群分別接種PRRSV GP5單克隆抗獨特型抗體Mab2-5G2及自身抗獨特型抗體,然后用CH-1R弱毒苗連續(xù)免疫兩次,最后HP-PRRSV攻毒,每次操作時間間隔是14天。檢測指標包括:觀察臨床癥狀、胸腺及肺的病理變化、血清中的病毒含量、細胞因子IFN-γ、IL-2/4/10及血清抗PRRSV特異性抗體和中和抗體水平,探討PRRSV抗獨特型抗體對CH-1R弱毒苗的調控效果。實驗結果顯示,PRRSV抗獨特型抗體降低了PRRSV弱毒苗的使用效果,誘導機體在病毒感染之前產生較高水平的IL-4及較低水平的中和抗體。該豬群與同型對照豬群相比,病毒感染后體溫較高且持續(xù)時間長,感染早期血清病毒含量較高。以上實驗結果表明,當機體PRRSV抗獨特型抗體存在時,頻率較高地進行疫苗的接種可能對豬群帶來一定的風險性。4、PRRSV單克隆抗獨特型單鏈抗體免疫學特性研究MAb2-5G2是PRRSV GP5的抗獨特型抗體,即“內影像”分子,能有模擬抗原表位而誘導機體的免疫反應,應用價值有待開發(fā);而單鏈抗獨特型抗體分子量小、沒有毒性且易于穿入組織細胞又容易在大腸桿菌中大量表達,較抗獨特型抗體優(yōu)勢明顯。我們前期的研究表明經過復性后的原核表達MAb2-5G2 sc Fv具備MAb2-5G2的生物學功能,對MAb2-5G2 sc Fv的免疫學功能的研究發(fā)現(xiàn):分別用MAb2-5G2v、sc Fv連續(xù)免疫兔子制備的抗血清能夠與彼此的抗原發(fā)生交叉反應且二者的抗血清能夠抑制HP-PRRSV感染Marc-145細胞。本實驗進一步研究MAb2-5G2sc Fv的免疫學特性,使用MAb2-5G2及其sc Fv接種實驗仔豬,結合PRRSV弱毒疫苗的使用,觀察二者對弱毒疫苗使用效果的影響。實驗豬群首先免疫接種PRRSV GP5單克隆抗獨特型抗體Mab2-5G2或Mab2-5G2Sc Fv,然后接種一次CH-1R弱毒苗,最后接種HP-PRRSV,觀察臨床癥狀、胸腺及肺的病理組織學變化、檢測病毒感染后血清病毒載量及血清抗PRRSV膜蛋白抗體水平。實驗結果顯示,MAb2-5G2 sc Fv保留了Mab2-5G2模擬GP5抗原的免疫學特性,二者在病毒感染后均較快地誘導機體產生了針對PRRSV膜蛋白的抗體,提高了HP-PRRSV感染仔豬的的成活率。
【關鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征 胸腺 自噬 凋亡 抗獨特型抗體 單鏈抗體
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• abstract9-17
• 第一章 豬繁殖與呼吸綜合征研究進展17-32
• 1.1 PRRSV的病原學特點17-20
• 1.1.1 PRRSV病原結構特點18-19
• 1.1.2 病毒的結構蛋白19
• 1.1.3 病毒的非結構蛋白19-20
• 1.2 PRRSV感染與機體的免疫反應20-22
• 1.2.1 PRRSV感染與機體的體液免疫反應20
• 1.2.2 PRRSV誘導機體的細胞免疫反應20
• 1.2.3 PRRSV感染與抗體依賴性增強作用20-21
• 1.2.4 免疫網絡學說21-22
• 1.2.5 單鏈抗體22
• 1.3 PRRSV的致病機制22-25
• 1.3.1 PRRSV細胞受體的研究23
• 1.3.2 PRRSV的感染對中樞免疫器官損傷的研究23-25
• 1.3.3 PRRSV感染可造成外周免疫器官的損傷25
• 1.4 PRRSV的感染與細胞的程序性死亡25-29
• 1.4.1 細胞自噬25-26
• 1.4.2 細胞凋亡26-27
• 1.4.3 PRRSV感染引起的自噬和凋亡27-29
• 1.5 PRRSV感染與防控29-32
• 1.5.1 PRRSV的傳播途徑29
• 1.5.2 PRRS的臨床癥狀29-30
• 1.5.3 PRRSV的防控現(xiàn)狀及其免疫30-32
• 第二章 本研究的目的與意義32-33
• 第三章 PRRSV感染引起胸腺內細胞的自噬和凋亡的研究33-50
• 3.1 試驗材料34-36
• 3.1.1 試驗動物和毒株34
• 3.1.2 主要試劑34
• 3.1.3 主要儀器34
• 3.1.4 主要試劑配制34-36
• 3.2 實驗方法36-40
• 3.2.1 動物實驗設計36
• 3.2.2 樣品的采集及處理36
• 3.2.3 胸腺的眼觀病理變化36
• 3.2.4 血清及胸腺內病毒載量的檢測36-37
• 3.2.5 流式細胞術檢測胸腺內細胞凋亡37-38
• 3.2.6 Western-blotting檢測PRRSV感染后胸腺內自噬和凋亡相關蛋白38-39
• 3.2.7 免疫共聚焦檢測PRRSV感染仔豬胸腺內自噬、凋亡情況39-40
• 3.2.8 免疫共聚焦檢測PRRSV感染仔豬胸腺內自噬細胞類型的鑒定40
• 3.2.9 數(shù)據(jù)分析40
• 3.3 結果分析40-48
• 3.3.1 胸腺的眼觀及病理變化40-41
• 3.3.2 血清及胸腺內病毒載量的檢測41
• 3.3.3 流式細胞術檢測胸腺內凋亡細胞41-42
• 3.3.4 Western-blotting檢測PRRSV感染后胸腺內自噬和凋亡相關蛋白42-44
• 3.3.5 HP-PRRSV感染仔豬胸腺內細胞自噬、細胞凋亡情況的鑒定44-48
• 3.4 討論48-49
• 3.5 小結49-50
• 第四章 PRRSV不同毒株弱毒疫苗對HP-PRRSV免疫保護作用的研究50-65
• 4.1 試驗材料50-51
• 4.1.1 毒株和疫苗50-51
• 4.1.2 試驗動物51
• 4.1.3 主要儀器及試劑51
• 4.2 實驗方法51-54
• 4.2.1 動物實驗設計51
• 4.2.2 臨床癥狀和病理變化的觀察51-52
• 4.2.3 樣品處理52
• 4.2.4 胸腺重量與仔豬體重比值計算52
• 4.2.5 病毒血癥檢測52
• 4.2.6 外周血中淋巴細胞亞群變化52-53
• 4.2.7 PRRSV特異性抗體的檢測53
• 4.2.8 細胞因子檢測53-54
• 4.3 結果分析54-62
• 4.3.1 臨床癥狀54-56
• 4.3.2 剖檢變化56-57
• 4.3.3 病理組織學變化57-58
• 4.3.4 血清中病毒載量變化58-59
• 4.3.5 PRRSV膜蛋白抗體水平變化59-60
• 4.3.6 實驗豬外周血T淋巴細胞亞群變化60-61
• 4.3.7 細胞因子的變化61-62
• 4.4 討論62-64
• 4.5 小結64-65
• 第五章 PRRSV抗獨特型抗體對弱毒苗的免疫調控65-80
• 5.1 試驗材料66
• 5.1.1 毒株、疫苗和細胞66
• 5.1.2 試驗動物66
• 5.1.3 主要儀器及試劑66
• 5.2 試驗方法66-70
• 5.2.1 免疫原的制備66-67
• 5.2.2 試驗設計67
• 5.2.3 臨床癥狀和病理變化的觀察67
• 5.2.4 樣品采集及處理67-68
• 5.2.5 血清病毒含量檢測68
• 5.2.6 PRRSV特異性抗體的檢測68
• 5.2.7 病毒中和試驗68-69
• 5.2.8 細胞因子的檢測69-70
• 5.3 結果分析70-77
• 5.3.1 臨床癥狀觀察結果70-71
• 5.3.2 剖檢結果觀察71-72
• 5.3.3 肺臟和胸腺的病理學變化72-73
• 5.3.4 血清中病毒載量檢測結果73-74
• 5.3.5 PRRSV特異性抗體的檢測74-75
• 5.3.6 細胞因子的檢測75-76
• 5.3.7 血清中和抗體的檢測76-77
• 5.4 討論77-78
• 5.5 小結78-80
• 第六章 PRRSV GP5 單克隆抗獨特型單鏈抗體免疫學特性研究80-88
• 6.1 試驗材料81
• 6.1.1 主要試劑及儀器81
• 6.1.2 毒株和疫苗81
• 6.1.3 實驗動物81
• 6.2 試驗方法81-82
• 6.2.1 免疫原的制備81
• 6.2.2 實驗設計81-82
• 6.2.3 臨床癥狀和病理變化的觀察82
• 6.2.4 血清病毒含量檢測82
• 6.2.5 PRRSV膜蛋白特異性抗體的檢測82
• 6.3 結果分析82-86
• 6.3.1 臨床癥狀觀察結果82-83
• 6.3.2 剖檢變化83-84
• 6.3.3 肺臟和胸腺的病理學變化84-85
• 6.3.4 血清病毒載量檢測85
• 6.3.5 PRRSV膜蛋白抗體水平變化85-86
• 6.4 討論86-87
• 6.5 小結87-88
• 全文總結88-89
• 本研究創(chuàng)新點89-90
• 參考文獻90-105
• 致謝105-106
• 作者簡介106

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：565719