本文關鍵詞：AvrRxo1調控水稻維生素B6合成影響水稻對條斑病抗性

  更多相關文章： AvrRxo1 調控 水稻 維生素 合成 影響 條斑 抗性

【摘要】：水稻細菌性條斑病(簡稱條斑病)是由條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola, Xoc)引起的,是水稻生產(chǎn)上危害嚴重的細菌病害之一。迄今尚未發(fā)現(xiàn)對條斑病菌免疫的水稻材料,也未從水稻中鑒定出控制條斑病的主效抗病基因。這一現(xiàn)象可能是由于條斑病菌中存在一個或多個依賴三型分泌系統(tǒng)的抑制因子,能夠抑制水稻防御基因產(chǎn)生的抗性。解析這些抑制因子的作用機理將有望破解水稻上缺失對條斑病主效抗性基因的謎題,對研發(fā)控制水稻條斑病危害的措施具有指導意義。為了克隆條斑病菌中的抑制因子,本研究構建了條斑病菌小種RS105的全基因組文庫,并將文庫質粒轉化至白葉枯病菌PXO99A中,在水稻抗性材料IRBB21上篩選病斑變長的感病克隆。對篩選到的感病克隆進行測序發(fā)現(xiàn),其中2個克隆的插入片段攜帶有一個共同的三型效應分子——AvrRxo1。進一步研究發(fā)現(xiàn),轉有pHM1: avrRxo1的PXO99A在IRBB21上的致病性顯著高于對照PXO99A (pHM1),說明效應分子AvrRxo1具有抑制因子的功能。與野生型條斑病菌RS105相比,avrRxol敲除突變體RS105△avrRxo1在成株期水稻上的致病力顯著降低,而突變體回復菌株致病力得到恢復,表明效應分子AvrRxo1在條斑病菌侵染水稻的致病過程中發(fā)揮著毒性因子的作用,有利于條斑病的發(fā)生。為了明確效應分子AvrRxo1在條斑病菌致病過程中發(fā)揮毒性因子的作用機制,本研究采用酵母雙雜交技術篩選到與AvrRxo1互作的水稻蛋白OsPDX1.2。OsPDX1.2為OsPDX1蛋白家族成員,該蛋白家族中的另兩個成員——OsPDX1.1和OsPDX1.3,與OsPDXl.2在氨基酸序列上高度相似,經(jīng)酵母雙雜交驗證發(fā)現(xiàn),OsPDX1.1和OsPDX1.3也可以與AvrRxo1相互作用。采用雙分子熒光互補實驗和免疫共沉淀實驗驗證AvrRxo1與OsPDX1蛋白間互作的真實性。實驗同時發(fā)現(xiàn),AvrRxo1與OsPDXl蛋白各自的羧基端在該相互作用發(fā)揮著不可或缺的作用。另外,實驗證明,OsPDX1家族蛋白成員自身和相互之間存在互作。此外,AvrRxo1也可以與擬南芥中AtPDX1蛋白家族成員及酵母中PDX1的同源蛋白SNZ1相互作用。這些結果表明,效應分子AvrRxo1可以與水稻(單子葉植物)、擬南芥(雙子葉植物)、酵母(真菌)中的PDX1蛋白互作。與野生型對照相比,超量表達OsPDX1的轉基因水稻對條斑病菌表現(xiàn)抗性,OsPDX1-RNAi轉基因植株和敲除突變體對條斑病菌表現(xiàn)為更加感病,表明OsPDXl正向調控水稻對條斑病的抗性。研究發(fā)現(xiàn),接種條斑病菌野生型菌株或突變體回復菌株能降低水稻中OsPDX1蛋白水平,而接種avrRxo1敲除突變體RS 105△avr Rxo1的水稻中OsPDX1蛋白水平與對照相比沒有顯著差異,暗示AvrRxo1可能具有蛋白酶活性。采用無細胞蛋白降解實驗和原核表達純化蛋白實驗進一步證實AvrRxo1具有蛋白酶活性,能夠降解OsPDX1蛋白。在擬南芥中誘導avrRxo1基因表達能夠降低PDX1蛋白的水平。同時,研究發(fā)現(xiàn)AvrRxo1降解OsPDX1是依賴ATP的。PDX1在真菌和植物中的功能高度保守,參與維生素B6的從頭合成。本研究發(fā)現(xiàn),在本氏煙中瞬時表達avrRxo1基因能夠降低本氏煙中維生素B6的水平。在水稻上接種條斑病菌野生型菌株或突變體回復菌株能夠降低水稻葉片中維生素B6的水平,而接種avrRxo1敲除突變體RS 105△avrRxo1的水稻中維生素B6的水平與對照相比無顯著差異。體外用維生素B6對水稻進行處理能夠提高水稻對條斑病菌的抗性。綜上,AvrRxo1可以通過降解PDX1蛋白影響植物中維生素B6的從頭合成,從而利于條斑病的發(fā)生。AvrRxo1能夠被非寄主抗性基因Rxol識別,并引起過敏性壞死反應。分析Rxol轉基因水稻在接種條斑病菌后OsPDX1基因的表達情況發(fā)現(xiàn),與野生型水稻材料相比,Rxol轉基因水稻中OsPDX1.3轉錄水平顯著提高。煙草瞬時表達實驗結果證明,Rxol和avrRxo1共表達時能夠誘導OsPDXl.3基因啟動子驅動的綠色熒光蛋白的表達,而avrRxo1或Rxo1單獨表達并沒有此功能。酵母雙雜交實驗證實Rxo1蛋白可以直接與AvrRxo1蛋白互作,在煙草中共表達時Rxo1能夠促進AvrRxo1蛋白進入細胞核。結合生物信息學預測結果,在OsPDx1.3基因的啟動子上鑒定了一個順式作用元件S000465,該順式作用元件在AvrRxo1激活OsPDX1.3基因表達過程中發(fā)揮著重要作用。將S000465順式作用元件與35Smini基礎啟動子融合來驅動GFP基因,同樣可以被AvrRxo1誘導表達。酵母單雜交實驗、凝膠阻滯實驗證實了AvrRxo1蛋白與S000465元件間的相互作用。綜上,在抗性基因Rxol存在的情況下,AvrRxo1蛋白的亞細胞定位發(fā)生變化,結合OsPDX1.3基因的啟動子,激活OsPDX1.3基因表達,可能促進維生素B6的從頭合成,對條斑病表現(xiàn)抗性。在利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選互作蛋白時發(fā)現(xiàn),AvrRxo1對酵母細胞具有毒性,而在培養(yǎng)基中添加維生素B6能夠解除AvrRxo1的毒性。本研究分別在氨基端和羧基端對AvrRxo1蛋白進行熒光蛋白標記時也發(fā)現(xiàn)：當在氨基端標記熒光蛋白后,AvrRxo1對擬南芥細胞的毒性消失,而在羧基端進行熒光蛋白標記的AvrRxo1蛋白對擬南芥細胞仍具有毒性,轉基因擬南芥根的伸長受到抑制。分析二者的亞細胞定位發(fā)現(xiàn),YFP-AvrRxo1定位于細胞核中,而AvrRxo1-GFP定位于細胞膜上。在培養(yǎng)基中添加維生素B6可以解除AvrRxo1-GFP擬南芥受到的生長抑制,恢復AvrRxo1-GFP轉基因植株根的伸長。這些研究結果表明,AvrRxo1發(fā)揮毒性功能可能與其降解PDX1影響維生素B6水平有關,毒性功能的發(fā)揮依賴其細胞膜定位。
【關鍵詞】：
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.4
【目錄】：

• 符號說明5-13
• 中文摘要13-16
• 英文摘要16-19
• 1 前言19-42
• 1.1 水稻條斑病的研究19-23
• 1.1.1 水稻條斑病的發(fā)生和分布19
• 1.1.2 水稻條斑病的癥狀19-20
• 1.1.3 水稻條斑病菌的研究20-21
• 1.1.3.1 水稻條斑病菌的命名20
• 1.1.3.2 水稻條斑病菌的形態(tài)學特征和理化性質20-21
• 1.1.3.3 水稻條斑病菌致病型的劃分21
• 1.1.4 水稻條斑病抗病基因的遺傳研究21-23
• 1.1.4.1 水稻對條斑病的數(shù)量抗性21-22
• 1.1.4.2 Rxo1基因克隆及抗性機制的研究22-23
• 1.2 黃單胞桿菌三型效應分子的研究23-32
• 1.2.1 三型效應分子抑制寄主植物抗性反應23-27
• 1.2.1.1 植物免疫系統(tǒng)23-24
• 1.2.1.2 病原相關分子模式和模式識別受體24-26
• 1.2.1.3 效應分子抑制植物抗性反應26-27
• 1.2.2 黃單胞桿菌三型效應分子27-32
• 1.2.2.1 野油菜黃單胞桿菌三型效應分子28-29
• 1.2.2.2 稻黃單胞桿菌TAL效應分子29-30
• 1.2.2.3 稻黃單胞桿菌非TAL(non-TAL)效應分子30-31
• 1.2.2.4 條斑病菌抑制水稻抗性反應的研究31-32
• 1.3 植物抗性基因作用機理32-33
• 1.3.1 基因對基因(gene for gene)假說32
• 1.3.2 防衛(wèi)假說32-33
• 1.3.3 捕獲假說33
• 1.4 蛋白質互作研究技術33-35
• 1.4.1 酵母雙雜交34
• 1.4.2 雙分子熒光互補34-35
• 1.4.3 免疫共沉淀35
• 1.5 蛋白質與DNA互作研究技術35-36
• 1.5.1 酵母單雜交技術35-36
• 1.5.2 凝膠阻滯分析36
• 1.5.3 染色體免疫沉淀技術36
• 1.6 維生素B6與植物生長發(fā)育和抗逆36-39
• 1.6.1 維生素B6的生物學功能36-37
• 1.6.2 維生素B6的合成途徑37-39
• 1.6.2.1 磷酸脫氧木糖依賴的合成途徑38
• 1.6.2.2 磷酸脫氧木糖不依賴的合成途徑38
• 1.6.2.3 維生素B6補救合成途徑38-39
• 1.6.3 維生素B6在植物抵御逆境中的作用39
• 1.7 本研究的目的和意義39-42
• 2 材料與方法42-59
• 2.1 植物材料與來源42
• 2.2 菌株與載體42-43
• 2.3 核酸、蛋白質操作43-45
• 2.3.1 植物DNA抽提43
• 2.3.2 RNA抽提43
• 2.3.3 RT-PCR和定量PCR分析43-44
• 2.3.4 蛋白質抽提與Western blot分析44-45
• 2.4 RS105全基因組文庫的構建45-47
• 2.4.1 RS105基因組DNA提取45
• 2.4.2 RS105基因組DNA部分酶切45-46
• 2.4.3 pEN1載體的片段化及連接轉化46
• 2.4.4 文庫質粒轉化至PX099A46-47
• 2.4.5 文庫質粒測序47
• 2.5 酵母雙雜交47-49
• 2.5.1 載體的構建47-48
• 2.5.2 酵母雙雜交文庫的創(chuàng)建48
• 2.5.3 Bait的自激活和毒性檢測48
• 2.5.4 酵母雙雜交文庫的篩選48-49
• 2.6 水稻基因的克隆與轉化49-50
• 2.6.1 超量表達載體的構建49
• 2.6.2 抑制表達載體的構建49
• 2.6.3 亞細胞定位載體的構建49
• 2.6.4 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化49-50
• 2.7 病原細菌的接種、病情調查和細菌生長分析50-51
• 2.7.1 水稻條斑病菌接種和病情分析50
• 2.7.2 水稻條斑病菌生長數(shù)量統(tǒng)計50
• 2.7.3 白葉枯病菌接種和病情分析50-51
• 2.7.4 白葉枯病菌生長數(shù)量統(tǒng)計51
• 2.7.5 丁香假單胞菌接種和病情分析51
• 2.7.6 丁香假單胞菌生長數(shù)量統(tǒng)計51
• 2.8 蛋白質互作檢測分析51-53
• 2.8.1 雙分子熒光互補52
• 2.8.2 免疫共沉淀驗證蛋白質互作52-53
• 2.9 PDX1蛋白檢測53-55
• 2.9.1 水稻中蛋白水平的檢測53
• 2.9.2 擬南芥中蛋白水平的檢測53
• 2.9.3 無細胞蛋白降解分析53-54
• 2.9.4 原核表達、純化蛋白54
• 2.9.5 體外AvrRxo1降解PDX1.2檢測54-55
• 2.10 維生素B6含量的測定55
• 2.10.1 植物中維生素B6的提取55
• 2.10.2 HPLC定量分析維生素B655
• 2.11 DNA-蛋白質互作55-58
• 2.11.1 瞬時表達系統(tǒng)驗證蛋白質調控基因表達55-56
• 2.11.2 酵母單雜交驗證核酸-蛋白質間的互作56
• 2.11.3 凝膠阻滯實驗驗證AvrRxo1與S000465元件間的互作56-57
• 2.11.4 染色體免疫沉淀實驗驗證AvrRxo1與S000465元件間的互作57-58
• 2.12 轉基因擬南芥的制備58-59
• 2.12.1 載體的構建58
• 2.12.2 擬南芥的轉化58
• 2.12.3 DEX處理誘導基因表達58-59
• 3 結果與分析59-102
• 3.1 AvrRxo1是條斑病菌中的抑制子能夠抑制水稻抗性反應59-65
• 3.1.1 RS105全基因組文庫的構建59
• 3.1.2 在水稻IRBB21上篩選感病轉化子59-60
• 3.1.3 抑制子亞克隆60-62
• 3.1.4 avrRxo1缺失影響條斑病在水稻上的致病力62-65
• 3.1.4.1 avrRxo1基因缺失影響條斑病菌在成株期水稻上的致病力62
• 3.1.4.2 avrRxo1基因缺失影響條斑病菌在成株期水稻上的生長繁殖62-63
• 3.1.4.3 avrRxo1基因缺失突變體競爭力低于野生型菌株63-64
• 3.1.4.4 avrRxo1互補菌株恢復對水稻的致病力64-65
• 3.2 AvrRxo1與OsPDX1蛋白互作65-75
• 3.2.1 AvrRxo1互作蛋白的篩選及驗證65-71
• 3.2.1.1 AvrRxo1亞細胞定位65-66
• 3.2.1.2 Bait_(avrRxo1-a)和Bait_(avrRxo1-b)自激活和毒性檢測66-68
• 3.2.1.3 利用酵母雙雜交篩選與AvrRxo1互作的水稻蛋白68
• 3.2.1.4 利用BiFC驗證AvrRxo1-OsPDX1.2互作68-69
• 3.2.1.5 CoIP驗證AvrRxo1-OsPDX1.2互作69
• 3.2.1.6 鑒定AvrRxo1蛋白與OsPDX1.2蛋白互作的結構域69-70
• 3.2.1.7 鑒定OsPDX1.2蛋白與AvrRxo1蛋白互作的結構域70-71
• 3.2.2 OsPDX1基因家族71-75
• 3.2.2.1 AvrRxo1蛋白與OsPDX1.1、OsPDX1.3蛋白互作72
• 3.2.2.2 OsPDX1家族蛋白的亞細胞定位72-73
• 3.2.2.3 OsPDX1家族蛋白形成同源和異源二聚體73-74
• 3.2.2.4 OsPDX1家族蛋白與OsPDX2互作74-75
• 3.2.2.5 AvrRxo1與AtPDX1家族蛋白互作75
• 3.2.2.6 AvrRxo1與酵母SNZ1蛋白互作75
• 3.3 OsPDX1正向調控水稻對條斑病菌的抗性75-81
• 3.3.1 OsPDX1超量表達T0代轉基因植株檢測76-77
• 3.3.2 OsPDX1超量表達T1代轉基因植株檢測77-79
• 3.3.3 T-DNA插入突變體檢測79-80
• 3.3.4 OsPDX1抑制表達T_0代轉基因植株檢測80-81
• 3.4 AvrRxo1具有蛋白酶活性能降解OsPDX1蛋白81-86
• 3.4.1 RS105接種影響水稻中OsPDX1蛋白水平82
• 3.4.2 AvrRxo1直接引起OsPDX1蛋白水平降低82-83
• 3.4.3 AvrRxo1直接降解OsPDX1蛋白83
• 3.4.4 AvrRxo1直接降解OsPDX1蛋白83-84
• 3.4.5 Western Blot檢測AvrRxo1降解OsPDX1.284-85
• 3.4.6 AvrRxo1降解OsPDX1蛋白需要ATP的存在85
• 3.4.7 AvrRxo1點突變影響其蛋白酶活性85-86
• 3.5 AvrRxo1干擾水稻維生素B6合成來促進致病86-91
• 3.5.1 OsPDX1參與水稻維生素B6的合成86-88
• 3.5.1.1 超量表達OsPDX1基因對水稻維生素B6水平的影響86-87
• 3.5.1.2 抑制表達OsPDX1基因對水稻維生素B6水平的影響87-88
• 3.5.2 AvrRxo1干擾植物維生素B6的合成88-90
• 3.5.2.1 AvrRxo1干擾水稻維生素B6的合成88-89
• 3.5.2.2 AvrRxo1表達降低本氏煙中維生素B6的水平89-90
• 3.5.3 維生素B6能夠解除AvrRxo1對酵母細胞的毒性90
• 3.5.4 維生素B6影響水稻對條斑病菌的抗性90-91
• 3.6 AvrRxo1蛋白調控OsPDX1基因表達91-96
• 3.6.1 AvrRxo1蛋白具有調控OsPDX1基因啟動子的功能91-92
• 3.6.2 OsPDX1基因啟動子中順式作用元件分析92
• 3.6.3 OsPDX1.3基因啟動子截短分析92-93
• 3.6.4 酵母單雜交檢測AvrRxo1蛋白與S000465元件互作93-94
• 3.6.5 凝膠阻滯實驗檢測AvrRxo1蛋白與S000465元件互作94-95
• 3.6.6 染色體免疫沉淀實驗檢測AvrRxo1蛋白與S000465元件互作95
• 3.6.7 酵母雙雜交檢測AvrRxo1與RXO1間的蛋白互作95-96
• 3.6.8 Rxo1蛋白影響AvrRxo1蛋白亞細胞定位96
• 3.7 AvrRxo1蛋白功能具有廣譜性96-99
• 3.7.1. avrRxo1誘導表達轉基因擬南芥制備96-97
• 3.7.2 AvrRxo1表達降低擬南芥中PDX1蛋白水平97-98
• 3.7.3 AvrRxo1表達對擬南芥表現(xiàn)毒性98
• 3.7.4 AvrRxo1表達促進丁香假單胞菌番茄變種在擬南芥上致病98-99
• 3.8 AvrRxo1蛋白亞細胞定位影響其功能99-102
• 3.8.1 超量表達熒光蛋白標記的AvrRxo1蛋白轉基因擬南芥制備99-100
• 3.8.2 不同位置標記熒光蛋白的AvrRxo1蛋白轉基因擬南芥表型100-102
• 4 討論102-110
• 4.1 AvrRxo1影響維生素B6合成的作用模型102-103
• 4.2 條斑病菌中抑制子的克隆進一步鑒定103-104
• 4.3 水稻對條斑病的階段性抗性104-106
• 4.3.1 水稻對條斑病具有階段性抗性104-105
• 4.3.2 水稻對條斑病的階段性抗性與維生素B6的關系105-106
• 4.4 AvrRxo1蛋白定位與功能間的關系106-108
• 4.4.1 蛋白質定位與功能間的關系106
• 4.4.2 AvrRxo1毒性功能依賴其膜定位106-107
• 4.4.3 AvrRxo1無毒因子功能依賴其核定位107-108
• 4.5 OsPDX1的應用108
• 4.6 關于后續(xù)工作的設想108-110
• 5 參考文獻110-129
• 6 附錄129-130
• 7 致謝130-131
• 8 攻讀學位期間發(fā)表論文情況131

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙帥;張子宇;馮家勛;;水稻黃單胞菌三型分泌系統(tǒng)效應物的研究進展[J];微生物學通報;2011年12期

2 裴俊國;鄒麗芳;鄒華松;陳功友;;水稻條斑病菌xopQ1_(Xoc)在病程中功能的初步研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2010年17期

3 韓慶典;陳志偉;鄧云;蘭濤;官華忠;段遠霖;周元昌;林閩川;吳為人;;水稻細菌性條斑病抗性QTLqBlsr5a的精細定位[J];作物學報;2008年04期

4 鄭景生,李義珍,方宣鈞;水稻第2染色體上細菌性條斑病抗性QTL的檢測[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2005年09期

5 曾建敏,林文雄;水稻細菌性條斑病及其抗性研究進展[J];分子植物育種;2003年02期

6 林擁軍,陳浩,曹應龍,吳昌銀,文靜,李亞芳,華紅霞;農(nóng)桿菌介導的牡丹江8號高效轉基因體系的建立[J];作物學報;2002年03期

7 姬廣海,許志剛,張世s，

本文編號：571487