本文關(guān)鍵詞：碳青霉烯不敏感大腸桿菌分子特征及NDM-1適應(yīng)性代價研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：碳青霉烯類抗生素是在人醫(yī)臨床上能夠有效治療由攜帶超廣譜β內(nèi)酰胺酶或頭孢西丁酶腸桿菌引起的嚴(yán)重感染的最重要的藥物之一,但是,隨著碳青霉烯類抗生素在人醫(yī)臨床上的應(yīng)用不斷增加,碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌也呈現(xiàn)出不斷增長的態(tài)勢。腸桿菌產(chǎn)生對碳青霉烯抗生素的耐藥主要原因就是獲得外源性的碳青霉烯酶,其中KPC型和NDM型碳青霉烯酶是目前流行最廣的兩種。大腸桿菌是人醫(yī)臨床和獸醫(yī)臨床上最常見的腸桿菌之一,也是條件性致病菌和體內(nèi)共生菌,其所帶來的危害是十分嚴(yán)重的,近年來碳青霉烯耐藥大腸桿菌在人醫(yī)臨床上的報道有逐年增加的趨勢。目前對于碳青霉烯耐藥大腸桿菌的研究多集中在人醫(yī)臨床上,對動物源和環(huán)境源大腸桿菌碳青霉烯耐藥流行病學(xué)調(diào)查缺乏研究資料。適應(yīng)性代價是指細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境條件變化而做出的改變,耐藥性的持續(xù)和擴散與適應(yīng)性代價有關(guān),多數(shù)研究表明細(xì)菌獲得耐藥性后,與敏感菌相比其生長力、毒力、穩(wěn)定性會發(fā)生變化,這種變化決定了其能否在宿主體內(nèi)或體外環(huán)境中長久存在。本實驗對分離自豬源和水源碳青霉烯類抗生素不敏感大腸桿菌進(jìn)行耐藥分子特征的研究,并研究了bla NDM-1基因在大腸桿菌內(nèi)的適應(yīng)性代價。本實驗收集了2009年至2014年分離自黑龍江不同地區(qū)規(guī)�；i場的豬源大腸桿菌488株和2013年至2014年分離自哈爾濱市馬家溝河水源大腸桿菌105株,運用微量肉湯稀釋法測定了593株大腸桿菌對22種抗菌藥物的MIC值。藥敏試驗結(jié)果顯示,豬源和水源大腸桿菌的耐藥性都比較嚴(yán)重,多重耐藥菌普遍存在,其中對阿莫西林、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率都超過了90%,兩種來源大腸桿菌除了在對阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、多粘菌素和替加環(huán)素的耐藥率有顯著性差異外,對其他抗生素耐藥率沒有顯著性差異。通過MIC值篩選出對碳青霉烯類抗生素厄他培南、亞胺培南和美羅培南不敏感大腸桿菌40株,其中豬源大腸桿菌22株,水源大腸桿菌18株,水源大腸桿菌對厄他培南、亞胺培南和美羅培南三種碳青霉烯類抗生素的MIC50值和MIC90值都大于豬源大腸桿菌,說明水源大腸桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性比豬源大腸桿菌嚴(yán)重。運用改良Hodge試驗和EDTA協(xié)同試驗,對40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌進(jìn)行表型篩選,結(jié)果顯示12株大腸桿菌改良Hodge試驗陽性,5株大腸桿菌EDTA協(xié)同試驗陽性,說明12株菌為疑似產(chǎn)碳青霉烯酶菌,5株菌為產(chǎn)金屬酶菌。PCR方法擴增40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中有可能存在的碳青霉烯酶基因(blaBIC、bla KPC、bla IMP、bla VIM、bla NDM、bla GIM、bla SPM、bla SIM、bla AIM、bla DIM、bla OXA-48)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(bla TEM、bla SHV、bla CTX-M、bla CTX-M-1組、bla CTX-M-2-組、bla CTX-M-8組、bla CTX-M-9-組、bla CTX-M-25-組、bla OXA)、Amp C酶基因(bla MOX、bla CMY、bla DHA、bla ACC、bla EBC、bla FOX)、質(zhì)粒介導(dǎo)的16Sr RNA甲基化酶基因(arm A、rmt A、rmt B、rmt C、rmt D、rmt E和npm A)和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因(qnr A、qnr B、qnr C、qnrD、qnr S、qep A、oqx AB、aac(6’)-Ib-cr)。結(jié)果顯示,40株大腸桿菌中,5株菌中檢出bla KPC基因,5株菌中檢出bla NDM基因,經(jīng)過測序確定了兩種基因的亞型分別為blakpc-2和blandm-1,其他類型的碳青霉烯酶基因沒有檢出;40株碳青霉烯酶不敏感大腸桿菌中全部擴增出了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因,其中以blactx-m基因的檢出率為最高,檢出率為95%(38/40),共檢出12種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分別為blatem-52、blashv-11、blashv-12、blactx-m-3、blactx-m-15、blactx-m-55、blactx-m-64、blactx-m-14、blactx-m-27、blactx-m-65、blactx-m-125和blaoxa-1基因,其中blatem-52基因是首次在豬源大腸桿菌中檢出;11株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中檢出了ampc酶基因,并且擴增出的都是blacmy基因,其他五種ampc酶基因沒有擴增到,經(jīng)過測序得到了兩種基因亞型分別為blacmy-2和blacmy-30;40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中16株檢出質(zhì)粒介導(dǎo)的16srrna甲基化酶基因,其中9株檢出arma基因,7株檢出rmtb基因;40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因的檢出率為82.5%(33/40),其中oqxab、qnrs、aac(6’)-ib-cr、qepa基因的檢出率分別為55%(22/40)、40%(16/40)、37.5%(15/40)和22.5%(9/40)。運用脈沖場凝膠電泳分型、多位點等位基因序列分型兩種方法對40株大腸桿菌進(jìn)行分子分型,結(jié)果顯示通過脈沖場凝膠電泳分型技術(shù)把40株大腸桿菌分成a~s共19個克隆株,除了c型、f型、g型、i型、k型、m型和r型屬于多克隆株外,其他12種克隆菌株都屬于單一克隆,證明豬源和水源碳青霉烯不敏感大腸桿菌以單克隆傳播為主,其中5株產(chǎn)kpc-2酶大腸桿菌分成5個克隆株,5株產(chǎn)ndm-1酶大腸桿菌分為4個克隆株;通過多位點等位基因序列分型方法將40株大腸桿菌分成了15個st型,其中除了包括cc10、cc23、cc38和cc405共4個克隆復(fù)合體外,其他11個st型都屬于單一序列型,攜帶kpc-2酶大腸桿菌屬于st69、st131、st405、st410和st648五種不同的st型,攜帶ndm-1大腸桿菌屬于st72、st131、st167和st410四種不同的st型。運用系統(tǒng)發(fā)育群分組分型方法對40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌進(jìn)行分型,結(jié)果24株屬于致病力弱的a型和b1型,16株屬于致病力強的b2型和d型,攜帶kpc-2酶大腸桿菌有3株屬于強致病力組,2株屬于弱致病力組,攜帶ndm-1酶大腸桿菌有4株屬于弱致病力組,只有1株屬于強致病力組,同時具備強致病力和強耐藥性的菌株對人醫(yī)臨床是個威脅。運用接合實驗的方法驗證碳青霉烯耐藥機制的可轉(zhuǎn)移性,結(jié)果顯示40株碳青霉烯不敏感大腸桿菌中12株接合成功,攜帶kpc-2酶的5株大腸桿菌和攜帶ndm-1的大腸桿菌都接合成功,并在接合子中擴增到了相應(yīng)的基因,證明了blakpc-2基因和blandm-1基因位于質(zhì)粒上可以水平移動,在接合成功的產(chǎn)kpc-2酶接合子中擴增到了兩種質(zhì)粒復(fù)制子分別為incn和inca/c,在產(chǎn)ndm-1酶接合子中也擴增到了兩種質(zhì)粒復(fù)制子分別為inca/c和incfii,證明是這三種質(zhì)粒介導(dǎo)了blakpc-2基因和blandm-1的水平傳播。采用引物步移法對5株產(chǎn)ndm-1酶大腸桿菌中的blandm-1基因周圍環(huán)境進(jìn)行分析,結(jié)果顯示blandm-1基因具有三種不同的基因環(huán)境,其中一種基因環(huán)境和鮑曼不動桿菌中blandm-1基因環(huán)境完全吻合,證明耐藥質(zhì)粒在腸桿菌和鮑曼不動桿菌之間發(fā)生了傳遞,另外兩種是典型的腸桿菌中blandm-1基因環(huán)境特征。體外構(gòu)建含有blandm-1啟動子在內(nèi)的克隆載體導(dǎo)入大腸桿菌dh5α,通過測定生長曲線和體外競爭常數(shù)分析blandm-1基因?qū)Υ竽c桿菌的適應(yīng)性代價,結(jié)果顯示blandm-1基因?qū)Υ竽c桿菌的生長沒有顯著的影響,blandm-1基因在大腸桿菌中的適應(yīng)性常數(shù)為0.93,屬于較弱的適應(yīng)性代價。通過測定bla NDM-1基因?qū)Υ竽c桿菌的適應(yīng)性代價常數(shù),證明大腸桿菌一旦獲得bla NDM-1基因,這種基因可以在大腸桿菌中穩(wěn)定傳播。
【關(guān)鍵詞】：大腸桿菌 碳青霉烯酶 KPC-2 NDM-1 分子特征 適應(yīng)性代價
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要10-13
• 英文摘要13-16
• 1 引言16-30
• 1.1 碳青霉烯類抗生素16-17
• 1.2 碳青霉烯類抗生素耐藥機制17-22
• 1.2.1 產(chǎn)生碳青霉烯酶17-21
• 1.2.2 其他耐藥機制21-22
• 1.3 NDM-1 酶研究進(jìn)展22-27
• 1.3.1 NDM-1 酶特點23-24
• 1.3.2 產(chǎn)NDM-1 酶大腸桿菌流行現(xiàn)狀24-25
• 1.3.3 產(chǎn)NDM-1 酶大腸桿菌的傳播和耐藥機制25-26
• 1.3.4 產(chǎn)NDM-1 酶大腸桿菌的實驗室診斷26
• 1.3.5 產(chǎn)NDM-1 酶大腸桿菌感染的治療26-27
• 1.4 適應(yīng)性代價27-29
• 1.5 研究目的與意義29-30
• 2 材料和方法30-57
• 2.1 材料30-33
• 2.1.1 菌株來源30
• 2.1.2 藥物30-31
• 2.1.3 主要試劑31-32
• 2.1.4 主要溶液的配制32
• 2.1.5 儀器設(shè)備32-33
• 2.2 方法33-57
• 2.2.1 細(xì)菌的復(fù)蘇33
• 2.2.2 細(xì)菌的分離與保存33-34
• 2.2.3 藥敏試驗34-37
• 2.2.4 表型試驗37
• 2.2.5 碳青霉烯酶耐藥基因檢測37-41
• 2.2.6 其他耐藥基因檢測41-44
• 2.2.7 PFGE分型44-47
• 2.2.8 多位點序列分型47-48
• 2.2.9 系統(tǒng)發(fā)育群分型48-49
• 2.2.10 質(zhì)粒接合試驗49-52
• 2.2.11 bla NDM-1 基因周圍序列檢測52-54
• 2.2.12 bla NDM-1 基因適應(yīng)性代價54-55
• 2.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計55-57
• 3 結(jié)果與分析57-84
• 3.1 細(xì)菌的復(fù)蘇與分離結(jié)果57
• 3.2 藥敏試驗結(jié)果57-64
• 3.2.1 豬源和水源大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果57-58
• 3.2.2 豬源和水源大腸桿菌多重耐藥性58-59
• 3.2.3 碳青霉烯不敏感大腸桿菌耐藥性59-64
• 3.3 表型試驗結(jié)果64-65
• 3.3.1 改良Hodge試驗64-65
• 3.3.2 金屬酶表型試驗65
• 3.4 碳青霉烯酶檢測結(jié)果65-67
• 3.5 其他耐藥基因檢測結(jié)果67-74
• 3.5.1 β-內(nèi)酰胺酶基因67-70
• 3.5.2 16S甲基化酶基因檢測結(jié)果70-71
• 3.5.3 PMQR基因檢測結(jié)果71-74
• 3.6 PFGE分型結(jié)果74-76
• 3.7 MLST分型結(jié)果76-77
• 3.8 系統(tǒng)發(fā)育群分型結(jié)果77-79
• 3.9 接合轉(zhuǎn)移試驗結(jié)果79-82
• 3.9.1 接合子藥敏試驗79-81
• 3.9.2 接合子質(zhì)粒復(fù)制子分型81-82
• 3.10 bla NDM-1 基因環(huán)境82
• 3.11 bla NDM-1 基因適應(yīng)性代價結(jié)果82-84
• 3.11.1 耐藥菌與敏感菌生長曲線82-83
• 3.11.2 耐藥菌與敏感菌體外競爭試驗83-84
• 4 討論84-94
• 4.1 耐藥性分析84-87
• 4.1.1 豬源大腸桿菌耐藥性分析84-86
• 4.1.2 水源大腸桿菌耐藥性分析86-87
• 4.2 碳青霉烯不敏感大腸桿菌耐藥性分析87-88
• 4.2.1 碳青霉烯不敏感大腸桿菌耐藥率87
• 4.2.2 碳青霉烯不敏感大腸桿菌表型篩選分析87-88
• 4.3 碳青霉烯不敏感大腸桿菌耐藥基因分析88-89
• 4.4 碳青霉烯不敏感大腸桿菌分型方法分析89-91
• 4.5 接合實驗分析91-92
• 4.6 bla NDM-1 基因周圍環(huán)境分析92-93
• 4.7 bla NDM-1 基因適應(yīng)性代價分析93-94
• 5 結(jié)論94-95
• 致謝95-96
• 參考文獻(xiàn)96-115
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文115

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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  本文關(guān)鍵詞：碳青霉烯不敏感大腸桿菌分子特征及NDM-1適應(yīng)性代價研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：430148