本文關(guān)鍵詞：JAKs-STATs信號通路關(guān)鍵基因在家兔腸炎發(fā)生中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：家兔腸炎是養(yǎng)兔業(yè)中危害最嚴重的消化道代謝疾病。根據(jù)腸炎病因的來源,可以將腸炎分為已知病原體的腸炎(腸炎)和未知病因的腸炎(非特異性腸炎)兩大類。目前普遍認為腸炎的發(fā)生主要與遺傳、免疫、環(huán)境等因素有關(guān),然而相關(guān)發(fā)病機制尚不清楚,有待深入深究。JAKs-STATs信號通路廣泛參與機體細胞的增殖、分化、存活、凋亡,介導(dǎo)機體免疫調(diào)控和腫瘤發(fā)生等生命活動過程,且有報道指出IL-23R-JAKs-STAT3信號通路與人類的炎癥性腸病(IBD)相關(guān)。因此,本試驗期望從JAKs和STATs兩大基因家族中,找到與家兔腸炎相關(guān)基因的cSNP,并探討JAKs-STAT3信號通路在家兔腸炎發(fā)病過程中的分子作用機制。本試驗采用case-control實驗設(shè)計,以480只新西蘭兔(case 253只,control 227只)為試驗對象,篩查JAK1, JAK2, TYK2, STAT1, STAT3和STAT5a基因的cSNP,并進行JAK1, STAT3基因與腸炎易感性的關(guān)聯(lián)性分析；在低纖維日糧誘導(dǎo)家兔腸炎群體中(60只),檢測JAK1, STAT3基因在回腸、結(jié)腸組織中的mRNA表達水平；通過培養(yǎng)家兔原代小腸上皮細胞(IEC)并用LPS構(gòu)建家兔IEC炎癥細胞模型；在炎癥細胞模型中篩選有效下調(diào)JAKs(JAK1, JAK2和TYK2)基因表達水平的高效siRNA分子和Western blot檢測STAT3蛋白表達水平,并利用RAN-Seq技術(shù)對轉(zhuǎn)染si-JAK1的IEC炎癥細胞模型組及對照組進行轉(zhuǎn)錄本的測序驗證,分析JAKs-STAT3在家兔腸炎發(fā)病中的不同作用。獲得以下主要結(jié)果：1. 利用PCR產(chǎn)物純化后直接測序法,篩查新西蘭兔JAKs和STATs兩個家族六個基因的編碼區(qū)cSNP,共發(fā)現(xiàn)22個cSNP,分別是JAK1 3個,JAK21個,TYK25個,STAT15個,STAT3 4個和STAT5 α4個。其中,JAK1 c.1421 CT和TYK2c.1477 CT是非同義突變,分別導(dǎo)致氨基酸p.Thr 474 Met (TM)和p.Leu 404 Phe (LF)的改變,其余的cSNP均為同義突變。通過非同義突變導(dǎo)致氨基酸損害程度分析和同義突變密碼子偏好性分析,選擇JAK1 c.1421, c.3036和STAT3 c.399, c.831四個cSNP進行家兔腸炎case-control關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK1等位基因C(c.1421)和A(c.3036)分別是風(fēng)險等位基因和保護等位基因；STAT3等位基因C(c.831)和G(c.399)分別是風(fēng)險等位基因和保護等位基因。運用多因子降維法(MDR)分析JAK1(c.1421 CT、 c.3036 AG)和STAT3 (c.399 GA、c.831 TC)基因的遺傳交互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四個cSNP組成8個遺傳交互作用模型,其中7個模型對家兔腸炎的易感性存在交互作用,模型(命名:c1421,c3036, c831)顯著地與家兔腸炎易感性相關(guān)(OR:2.7262; 95% CI:4.7408-5.1986; P0.0001)。2. 在低纖維日糧誘導(dǎo)試驗的家兔群體中,熒光定量PCR(qPCR)試驗分析發(fā)現(xiàn)JAK1 (c.1421 CT)基因在回腸和結(jié)腸中的嚴重組表達量最高,分別為0.2398±0.0145 和 0.1835±0.0175。JAK1基因在嚴重組回腸中的表達量極顯著高于健康組(P=0.0056),顯著高于輕微炎癥組(P=0.039)。在回腸中CC基因型的表達量與CT和TT基因型表達量的差異分別達到顯著水平(P=0.031)和極顯著水平(P=0.0082)；在結(jié)腸中只有CC基因型與TT基因型的mRNA表達量呈現(xiàn)顯著相關(guān)(P=0.026)。STAT3(c.399 GA)基因在回腸和結(jié)腸中的嚴重組表達量最高,分別為0.3598±0.0249和0.2881±0.0671。STAT3基因在嚴重組回腸中的表達量極顯著高于健康組(P=.0089),顯著高于輕微炎癥組(P=0.013),健康組和輕微組相互之間差異也達到顯著水平(P=0.045)。在回腸中AA基因型的表達量與GG基因型表達量的差異達到極顯著水平(P=0.0012)；在結(jié)腸中AA基因型與AG、GG基因型的mRNA表達量均呈現(xiàn)顯著相關(guān)(P=0.036,P=0.029),而AG和GG基因型之間的mRNA表達水平差異不顯著(P=0.219)。3.采用膠原酶I (0.2 mg/ml)成功分離培養(yǎng)家兔原代IEC,運用相差消化法及相差貼壁法純化IEC,經(jīng)CK-18單克隆抗體鑒定其純度達95%以上。純化后的IEC培養(yǎng)體系中添加終濃度為1000 ng/ml的LPS并作用24 h,再利用ABC-ELISA法檢測到LPS模型組中IL-1β、TNF-α兩個經(jīng)典的急性炎癥早期細胞因子含量均顯著高于同時段對照組(P0.01),結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)兔IEC炎癥細胞模型構(gòu)建成功。4.利用陽性對照si-Pcontrol-GAPDH和熒光Cy3標記的陰性對照si-Ncontrol 05815確定了最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系,獲得能夠有效下調(diào)JAK1,JAK2和TYK2基因表達的siRNA分子(si-JAK1-001, si-JAK2-001和si-TYK2-003)。通過調(diào)整siRNA轉(zhuǎn)染的終濃度,使其沉默靶基因的效率基本一致(70%),通過qPCR檢測STAT3基因在已轉(zhuǎn)染高效siRNA的炎癥細胞模型中mRNA表達水平,以及利用Westeren blot分析p-STAT3(Tyr 705)和STAT3,總蛋白的表達量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK1、JAK2、 TYK2分別下調(diào)STAT3基因的mRNA表達水平為76.34%、23.89%和42.14%,分別下調(diào)p-STAT3表達水平0.71%,0.24%和0.35%,而總蛋白水平卻沒有明顯變化,表明JAK1是導(dǎo)致STAT3 (Tyr 705)位磷酸化的主因。5. 通過RNA-Seq技術(shù)對轉(zhuǎn)染si-JAKl-001的IEC炎癥細胞模型和對照組的測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用RNA fragmentation策略構(gòu)建測序文庫可以獲得良好的測序隨機性和較高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù),與參考基因比對率約為40.05%,并且大約65%基因的Coverage達到90-100%。RNA-Seq基因差異表達分析發(fā)現(xiàn)兩組重復(fù)試驗有491個上調(diào)基因,780個下調(diào)基因,涉及到壓力應(yīng)答,類固醇激素刺激應(yīng)答以及免疫系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)過程。RNA-Seq進一步證實si-JAK1-001可以有效沉默JAK1基因。Pathway顯著性富集分析揭示JAKs-STATs信號通路中相關(guān)基因的功能與家兔IEC炎癥細胞模型的免疫應(yīng)答相關(guān),且JAK1選擇性顯著下凋STAT1、STAT3、STAT5b基因的表達水平。本研究著重揭示JAK1和STAT3基因與家兔腸炎易感性的關(guān)系；闡述JAK1是激活STAT3(Tyr705)位磷酸化的主因,從而加劇家兔腸炎的發(fā)生,為家兔腸炎的分子抗病育種和JAKs、STATs激酶抑制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：腸炎 JAKs-STATs cSNP siRNA RNA-Seq
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.291
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 專業(yè)術(shù)語縮寫表10-17
• 第一章 文獻綜述17-41
• 1 家兔消化系統(tǒng)和腸道免疫的特征17-19
• 2 家兔腸炎研究進展19-24
• 2.1 家兔腸炎的分類19-20
• 2.2 家兔腸炎的防治20
• 2.3 腸炎免疫的分子機制20-24
• 2.3.1 IBD的發(fā)病機制20-21
• 2.3.2 天然免疫與腸炎21-23
• 2.3.3 獲得性免疫效應(yīng)分子與腸炎23-24
• 3 JAKs/STATs信號通路與腸炎的研究進展24-29
• 3.1 JAKs-STATs信號通路的組份24-26
• 3.2 JAKs-STATs信號通路的作用機制26-27
• 3.3 JAKs-STATs信號通路與免疫調(diào)節(jié)(腸炎)研究進展27-29
• 3.3.1 JAKs-STATs信號通路在腸炎發(fā)生中的作用研究進展28
• 3.3.2 JAKs-STATs信號通路在腸炎藥物研發(fā)中的應(yīng)用進展28-29
• 4 本試驗涉及到的主要分子生物學(xué)實驗技術(shù)29-38
• 4.1 HRM基因分型技術(shù)29-31
• 4.1.1 HRM基因分型原理29-30
• 4.1.2 HRM主要技術(shù)特點30
• 4.1.3 HRM的發(fā)展與應(yīng)用30-31
• 4.2 RNAi技術(shù)的應(yīng)用31-36
• 4.2.1 RNAi技術(shù)歷史回顧32
• 4.2.2 RNAi的作用機制32-35
• 4.2.3 RNAi在動物功能基因組研究中的應(yīng)用35-36
• 4.3 RNA-Seq技術(shù)介紹36-38
• 4.3.1 RNA-Seq技術(shù)特點37
• 4.3.2 RNA-Seq在畜禽遺傳育種研究中的運用37-38
• 5 本試驗研究目的及主要內(nèi)容38-41
• 5.1 本試驗?zāi)康募耙饬x38-39
• 5.2 本試驗的主要內(nèi)容39-40
• 5.3 本試驗技術(shù)路線40-41
• 第二章 JAKs和STATs家族基因多態(tài)性及相互作用與家兔腸炎易感性分析41-81
• 1 試驗材料41-43
• 1.1 case-control腸炎易感性樣本群構(gòu)建及樣本采集41-42
• 1.2 低纖維日糧腸炎兔群的構(gòu)建及樣本采集42-43
• 2 儀器設(shè)備與試劑配制43-46
• 2.1 主要儀器設(shè)備43-44
• 2.2 主要試劑及配制44-46
• 2.2.1 主要試劑盒及試劑44-45
• 2.2.2 主要試劑的配制45-46
• 3 試驗方法46-59
• 3.1 低纖維日糧家兔腸炎炎癥程度分類46-47
• 3.1.1 臨床觀察和解剖癥狀評分46
• 3.1.2 組織病理切片HE染色觀察46
• 3.1.3 低纖維誘導(dǎo)試驗中家兔炎癥嚴重程度分類46-47
• 3.2 DNA和RNA的提取和檢測47-50
• 3.2.1 基因組DNA的提取47-48
• 3.2.2 總RNA抽提48-49
• 3.2.3 DNA、RNA濃度和純度的檢測49
• 3.2.4 cDNA的合成49-50
• 3.3 JAKs和STATs基因引物設(shè)計、PCR擴增和cSNP檢測50-54
• 3.3.1 引物設(shè)計與合成50-52
• 3.3.2 常規(guī)PCR反應(yīng)體系及條件52-53
• 3.3.3 PCR產(chǎn)物的純化和膠回收53
• 3.3.4 直接測序和變異位點篩選53-54
• 3.4 PCR-RFLP和HRM技術(shù)進行基因分型54-56
• 3.4.1 PCR-RFLP基因分型54-55
• 3.4.2 HRM基因分型55-56
• 3.5 JAK1和STAT3基因qPCR分析mRNA表達水平56-57
• 3.6 數(shù)據(jù)處理57-59
• 3.6.1 主要分子生物學(xué)軟件57-58
• 3.6.2 多態(tài)信息與相關(guān)性統(tǒng)計分析58-59
• 3.6.3 qPCR組織表達研究統(tǒng)計分析59
• 4 試驗結(jié)果與分析59-75
• 4.1 低纖維日糧誘導(dǎo)家兔腸炎炎癥程度的分類59-60
• 4.2 基因組DNA和總RNA提取結(jié)果60-61
• 4.2.1 基因組DNA提取結(jié)果60-61
• 4.2.2 總RNA提取結(jié)果61
• 4.3 JAKs和STATs家族基因編碼區(qū)擴增和直接測序結(jié)果61-64
• 4.4 分析篩選關(guān)鍵cSNP位點64-66
• 4.4.1 非同義突變cSNP導(dǎo)致氨基酸損害程度的變化64
• 4.4.2 同義突變cSNP密碼子偏好性分析結(jié)果64-66
• 4.5 JAK1 c.1421,c.3036和STAT3 c.399,c.831基因分型結(jié)果66-68
• 4.5.1 JAK1基因PCR-RFLP分型結(jié)果66-67
• 4.5.2 STAT3基因HRM分型結(jié)果67-68
• 4.6 JAK1和STAT3基因與家兔腸炎易感性分析68-73
• 4.6.1 JAK1基因c.1421和c.3036對家兔腸炎易感性分析68-69
• 4.6.2 STAT3基因c.399和c.831對家兔腸炎易感性分析69-72
• 4.6.3 JAK1和STAT3基因?qū)δc炎易感性的遺傳交互作用分析72-73
• 4.7 JAK1和STAT3基因在回腸和結(jié)腸組織mRNA的表達水平分析73-75
• 4.7.1 JAK1基因在回腸和結(jié)腸組織mRNA表達水平分析73-74
• 4.7.2 STAT3基因在回腸和結(jié)腸組織mRNA表達水平分析74-75
• 5 討論75-79
• 5.1 分析試驗家兔腸炎分組的可靠性75-76
• 5.2 JAKs和STATs兩個家族基因cSNP功能性分析76-77
• 5.3 JAK1和STAT3基因cSNP和交互作用影響家兔腸炎易感性77-79
• 5.4 JAK1和STAT3基因回腸和結(jié)腸組織mRNA表達水平差異分析79
• 6 本章小結(jié)79-81
• 第三章 新生仔兔小腸上皮細胞LPS炎癥細胞模型構(gòu)建81-99
• 1 試驗材料與試劑81-85
• 1.1 試驗材料81
• 1.2 主要儀器設(shè)備及試劑(配制)81-85
• 1.2.1 儀器設(shè)備81-82
• 1.2.2 細胞培養(yǎng)耗材82-83
• 1.2.3 主要試劑(盒)購買及配制83-85
• 2 試驗方法85-90
• 2.1 家兔原代IEC的分離、培養(yǎng)與純化85-86
• 2.1.1 IEC原代消化和傳代培養(yǎng)法85-86
• 2.1.2 IEC的純化86
• 2.2 家兔IEC的鑒定86-88
• 2.2.1 IEC形態(tài)學(xué)觀察86-87
• 2.2.2 IEC生長曲線的測定87
• 2.2.3 CK-18單克隆抗體的免疫組化鑒定87-88
• 2.3 IEC炎癥細胞模型的構(gòu)建88-89
• 2.3.1 LPS藥物劑量篩選試驗88-89
• 2.3.2 LPS刺激IEC炎癥細胞模型試驗89
• 2.3.3 ABC-ELISA法測定炎癥細胞模型中IL-1β和TNF-α89
• 2.4 數(shù)據(jù)處理89-90
• 3 試驗結(jié)果與分析90-97
• 3.1 成功分離、培養(yǎng)與純化家兔IEC90-93
• 3.1.1 IEC的形態(tài)學(xué)觀察90-92
• 3.1.2 IEC生長曲線繪制92
• 3.1.3 CK-18單克隆抗體的免疫組化鑒定92-93
• 3.2 利用LPS成功構(gòu)建IEC炎癥模型93-97
• 3.2.1 確定LPS藥物劑量93-95
• 3.2.2 炎癥細胞模型中IL-1β、TNF-α的含量顯著提高95-97
• 4 討論97-98
• 4.1 成功分離培養(yǎng)、純化和鑒定家兔原代IEC97-98
• 4.2 LPS成功誘導(dǎo)兔IEC炎癥細胞模型構(gòu)建98
• 5 本章小結(jié)98-99
• 第四章 JAK1,JAK2和TYK2與STAT3基因?qū)彝肐EC炎癥發(fā)生的作用研究99-121
• 1 試驗材料與試劑100-104
• 1.1 細胞的選擇100
• 1.2 主要儀器設(shè)備及耗材100
• 1.3 主要試劑(配制)100-104
• 1.3.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染試劑100-101
• 1.3.2 siRNA序列信息101-102
• 1.3.3 抗體102
• 1.3.4 主要試劑配制102-104
• 2 試驗方法104-111
• 2.1 Lip2000轉(zhuǎn)染siRNA進入IEC104-106
• 2.2 qPCR篩選高效下調(diào)目的基因表達水平的siRNA分子106
• 2.2.1 細胞RNA的提取106
• 2.2.2 cDNA的合成106
• 2.2.3 qPCR篩選siRNA106
• 2.3 檢測STAT3在轉(zhuǎn)染siRNAs炎癥細胞模型mRNA和蛋白水平106-111
• 2.3.1 qPCR檢測STAT3基因的mRNA表達水平107
• 2.3.2 Western blot分析STAT3蛋白表達水平107-111
• 2.4 ABC-ELISA檢測si-JAK1-001 IEC炎癥細胞模型中IL-1β和TNF-α的表達水平111
• 2.5 數(shù)據(jù)分析111
• 3 試驗結(jié)果與分析111-116
• 3.1 成功構(gòu)建siRNA的Lip2000轉(zhuǎn)染方法111-113
• 3.2 成功篩選下調(diào)目的基因表達水平的si-JAKs113-114
• 3.3 JAKs在IEC炎癥細胞模型中激活STAT3的作用114-116
• 3.4 JAK1基因沉默后對IEC炎癥模型中IL-1β和TNF-α表達水平的影響116
• 4 討論116-120
• 4.1 優(yōu)化Lip2000轉(zhuǎn)染體系116-117
• 4.2 篩選高效的siRNA分子117-118
• 4.3 家兔IEC炎癥細胞模型中JAK1是激活STAT3的主要因子118-120
• 5 本章小結(jié)120-121
• 第五章 JAK1基因沉默后IEC炎癥細胞模型的RNA-Seq表達譜分析121-140
• 1 試驗材料與試劑121-122
• 1.1 細胞模型121
• 1.2 主要儀器和試劑121-122
• 1.2.1 主要儀器設(shè)備121-122
• 1.2.2 主要試劑122
• 2 試驗方法122-128
• 2.1 細胞總RNA的提取和純化122-123
• 2.2 RNA樣品的質(zhì)量鑒定123
• 2.3 RNA-Seq文庫構(gòu)建及測序123-124
• 2.4 數(shù)據(jù)分析124-128
• 2.4.1 原始序列數(shù)據(jù)的處理125-126
• 2.4.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估126-127
• 2.4.3 差異表達基因的分析127-128
• 3 結(jié)果與分析128-137
• 3.1 純化后總RNA的檢測結(jié)果128-129
• 3.2 RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量評估報告129-133
• 3.2.1 Raw reads質(zhì)量評估129
• 3.2.2 Clean reads比對統(tǒng)計結(jié)果129-130
• 3.2.3 測序隨機性評估結(jié)果130-131
• 3.2.4 Reads在基因組上的分布131-132
• 3.2.5 基因覆蓋度統(tǒng)計132-133
• 3.3 基因差異表達分析133-137
• 3.3.1 case-control差異表達基因篩選133-134
• 3.3.2 GO功能顯著性富集分析134-136
• 3.3.3 Pathway顯著性富集分析136-137
• 4 討論137-139
• 4.1 試驗設(shè)計和測序方案的選擇137-138
• 4.2 JAKs-STATs在IEC炎癥細胞模型中分子作用的研究138-139
• 5 本章小節(jié)139-140
• 第六章 研究結(jié)論與展望140-142
• 1 本研究主要結(jié)論140
• 2 本研究的主要創(chuàng)新點140-141
• 3 下一步研究展望141-142
• 參考文獻142-155
• 致謝155-156
• 攻讀學(xué)位期間完成的學(xué)術(shù)成果156

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1 付陸;JAKs-STATs信號通路關(guān)鍵基因在家兔腸炎發(fā)生中的作用研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：JAKs-STATs信號通路關(guān)鍵基因在家兔腸炎發(fā)生中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：430107