本文關(guān)鍵詞：甘露糖受體介導(dǎo)的多糖重組抗原銅綠假單胞菌疫苗的研制及其免疫分子機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著免疫學(xué)研究的不斷深入和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為避免傳統(tǒng)滅活苗接種劑量較大，產(chǎn)生免疫力較慢，弱毒苗毒力返強的缺點，針對不同疾病已開展了各種新型基因工程疫苗的研制。但這些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、難以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答等不足，從而需要某種載體或佐劑來彌補這種不足。傳統(tǒng)載體或佐劑又存在許多缺陷，如引起局部炎癥反應(yīng)、致癌、不易在體內(nèi)降解等，所以需要研發(fā)新型載體或佐劑來克服上述缺點[183]。 殼聚糖，是來自甲殼素的天然高分子多糖，在體內(nèi)其能被溶菌酶生物降解。具有黏膜粘附的特點，是一種黏膜吸收增強劑，己被用作黏膜給藥的載體。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)由乳酸和羥基乙酸隨機聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機化合物[186]，具有良好的生物相容性、成囊、成膜和無毒性。在美國PLGA已通過FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國藥典[187]。甘露糖是目前唯一用于在臨床上的糖質(zhì)營養(yǎng)素，其可直接被利用合成糖蛋白，參與免疫細(xì)胞上甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞等免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步激活T淋巴細(xì)胞，提高M(jìn)HC-I和MHC-II分子的抗原遞呈。因此運用殼聚糖、PLGA和甘露糖這三種可生物降解材料作為新型的疫苗載體或佐劑具有巨大的潛力。 本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，從銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853和銅綠假單胞菌水貂分離株DL9基因組中獲得外膜蛋白OprF190-342和OprI21-83的基因，并通過融合PCR的方法將其融合在一起。利用DNAStar、DNAMAN和多個生物學(xué)網(wǎng)站對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。OprF190-342-OprI21-83基因的核苷酸序列在銅綠假單胞菌不同菌株間高度保守；蛋白成親水性，二級結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主。隨后綜合多種有利于直接表達(dá)具有活性重組蛋白的條件，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功可溶性表達(dá)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853的外膜蛋白OprF190-342-OprI21-83（FI），利用凝血酶去除其載體上的GST標(biāo)簽，實現(xiàn)無標(biāo)簽蛋白FI的可溶性表達(dá)。 巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面都具有豐富甘露糖受體（MMR）的表達(dá)，用甘露糖修飾載體，則能通過受體介導(dǎo)的吞噬作用，來提高細(xì)胞對于藥物的攝取。因此，本研究以甘露糖和殼聚糖為材料，在氰基硼氫化鈉的催化下，使甘露糖的羧基與殼聚糖的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，將甘露糖修飾到殼聚糖上，獲得甘露糖修飾的殼聚糖衍生物。以已獲得的銅綠假單胞菌外膜融合蛋白FI為模式抗原，采用離子凝聚法和復(fù)乳法成功制備了含有抗原FI的殼聚糖微球載體疫苗（FI-CS-MPs）、甘露糖修飾的殼聚糖微球載體疫苗（FI-MCS-MPs）、殼聚糖包衣的PLGA微球載體疫苗（FI-CP-MPs）和甘露糖修飾的殼聚糖包衣的PLGA微球載體疫苗（FI-MCP-MPs）。并通過掃描電鏡、粒徑測定儀、BCA蛋白濃度測定等方法對這四種生物可降解多糖微球載體疫苗的表征進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示四種微球疫苗均成正球體，形態(tài)規(guī)則，分散性良好，表面不光滑成粗糙狀態(tài)，，無褶皺；平均粒徑大小都在2~3μm；包封率與載藥量良好；在體外抗原釋放實驗中，可降解多糖微球載體疫苗在最初的12小時內(nèi)釋放出約30%~50%的抗原FI，并且經(jīng)過甘露糖修飾的微球載體疫苗的釋放率始終高于未經(jīng)甘露糖修飾的微球載體疫苗。 以獲得的四種可降解多糖微球載體疫苗為基礎(chǔ)，將模式抗原FI標(biāo)記上FITC熒光，通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦兩種免疫學(xué)技術(shù)，比較小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對這四種可降解多糖微球載體疫苗的攝取情況。結(jié)果顯示，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對含有FITC-FI的微球載體疫苗的攝取率比游離的FITC-FI顯著增高；且對甘露糖修飾的微球載體疫苗攝取率最高，顯著高于對照組。通過免疫熒光和免疫組化的方法，體內(nèi)外均成功驗證經(jīng)過甘露糖修飾的微球載體疫苗可以靶向小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠NALT組織上的巨噬細(xì)胞甘露糖受體。 本研究利用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和NF-κB和MAPK信號通路試劑盒，通過Western-blot方法，揭示生物可降解多糖微球載體疫苗可以顯著激活小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7NF-κB和MAPK信號通路。并且經(jīng)過甘露聚糖抑制甘露糖受體，甘露糖修飾的殼聚糖微球載體疫苗激活這兩條信號通路的現(xiàn)象明顯消失。 用獲得的生物可降解多糖微球載體疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，間接ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫后各個時間點小鼠黏膜和系統(tǒng)體液特異性抗體水平和T淋巴細(xì)胞亞型情況。結(jié)果顯示，在體液水平方面，最先檢測到的抗體為肺臟研磨液中的FI特異性IgM，隨著免疫時間的延續(xù)其抗體效價逐漸減少；在鼻腔灌洗液和支氣管灌洗液中，甘露糖修飾的殼聚糖微球組特異性IgA抗體效價在免疫初期顯著高于對照組；并且在滴鼻免疫的遠(yuǎn)端黏膜部位小腸灌洗液中，與對照組相比甘露糖修飾的殼聚糖微球組特異性IgA抗體水平也顯著增高；在激活黏膜部位抗體水平的同時，在血清中的特異性IgA和IgG水平也顯著增高，甘露糖修飾的殼聚糖微球組顯著高于對照組。肺臟、小腸派爾氏結(jié)和脾臟中，甘露糖修飾的殼聚糖微球組的T淋巴細(xì)胞亞型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+均顯著升高，并伴隨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4和IFN-γ的顯著表達(dá)，提示甘露糖修飾的微球疫苗呈現(xiàn)混合Th1/Th2反應(yīng)。生物可降解多糖微球載體疫苗可以顯著提高最小致死量銅綠假單胞菌攻毒小鼠的存活率。 在BALB/c小鼠體內(nèi)，生物降解多糖微球載體疫苗具有良好的滴鼻免疫效果，隨后本研究通過間接ELISA和HE染色組織學(xué)觀察等方法，研究其在本體動物水貂中滴鼻黏膜免疫后，抗體水平的變化情況，評價其免疫效果。結(jié)果顯示，甘露糖修飾的微球疫苗組在免疫初期的血清IgG抗體水平顯著高于對照組，且持續(xù)到免疫觀察末期。殼聚糖微球載體疫苗可以顯著提高銅綠假單胞菌攻毒水貂的存活率，F(xiàn)I-CS-MPs、FI-CP-MPs、FI-MCS-MPs和FI-MCP-MPs組水貂的存活率分別是62.5%、62.5%、75%和62.5%，但由于實驗過程中的攻毒過程為急性感染，所以甘露糖修飾的殼聚糖微球疫苗組存活率與未經(jīng)甘露糖修飾的殼聚糖微球疫苗組存活率無顯著差異。組織學(xué)觀察，殼聚糖微球載體疫苗可以顯著減輕銅綠假單胞菌攻毒水貂肺臟和脾臟的炎癥反應(yīng)。 總之，本研究成功制備含有銅綠假單胞菌外膜融合蛋白FI的經(jīng)過甘露糖修飾的殼聚糖可生物降解微球載體疫苗（FI-MCS-MPs和FI-MCS-MPs）。體內(nèi)外驗證其可以靶向巨噬細(xì)胞甘露糖受體。經(jīng)過BALB/c小鼠和本體動物水貂滴鼻免疫以后，顯示與對照組相比其可以較早的顯著增強黏膜和系統(tǒng)體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，呈現(xiàn)混合Th1/Th2反應(yīng)。對銅綠假單胞菌攻擊的小鼠和水貂具有很好的保護(hù)率。因此，甘露糖修飾的殼聚糖可生物降解微球載體是一個很有潛力的可生物降解滴鼻黏膜免疫疫苗載體。為生物可降解多糖微球載體疫苗在水貂等經(jīng)濟(jì)毛皮動物中的應(yīng)用提供可靠的理論和實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 生物降解 微球疫苗 甘露糖受體 黏膜免疫 殼聚糖
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-18
• 英文縮寫詞表18-19
• 引言19-21
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述21-45
• 第一章 甘露糖受體靶向傳遞系統(tǒng)的研究進(jìn)展21-27
• 1.1 甘露糖受體概況21-24
• 1.1.1 甘露糖受體類型21-23
• 1.1.2 甘露糖受體的多聚化和親和力23-24
• 1.2 甘露糖受體對抗原的攝取與遞呈24-25
• 1.3 甘露糖受體的免疫激活25
• 1.4 甘露糖受體的靶向疫苗相關(guān)研究25-27
• 第二章 生物降解材料簡述27-33
• 2.1 殼聚糖27-29
• 2.1.1 殼聚糖基本性質(zhì)27-28
• 2.1.2 離子凝聚法制備殼聚糖微球28-29
• 2.2 PLGA29-31
• 2.2.1 PLGA 基本性質(zhì)29-30
• 2.2.2 PLGA 疫苗相關(guān)研究30-31
• 2.3 殼聚糖和 PLGA 的吸附靜電作用31-33
• 第三章 鼻黏膜免疫微球載體疫苗33-39
• 3.1 鼻黏膜免疫的特點33-35
• 3.1.1 鼻黏膜免疫的優(yōu)點33-35
• 3.1.2 鼻黏膜免疫的缺點35
• 3.2 鼻黏膜免疫殼聚糖載體疫苗近期研究進(jìn)展35-36
• 3.3 黏膜免疫甘露糖修飾的殼聚糖載體疫苗近期研究進(jìn)展36-39
• 第四章 銅綠假單胞菌疫苗研究進(jìn)展39-45
• 4.1 脂多糖（LPS）和 O-多糖疫苗39-41
• 4.2 粘液胞外多糖疫苗41
• 4.3 鞭毛疫苗41-42
• 4.4 菌毛疫苗42-43
• 4.5 外膜蛋白疫苗43-45
• 第二篇 研究內(nèi)容45-145
• 第一章 重組抗原銅綠假單胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83基因克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析45-69
• 1.1 材料45-47
• 1.1.1 菌株和表達(dá)載體45-46
• 1.1.2 主要試劑46
• 1.1.3 儀器和設(shè)備46
• 1.1.4 試劑的配制46-47
• 1.2 方法47-54
• 1.2.1 銅綠假單胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83基因克隆表達(dá)與鑒定47-53
• 1.2.2 銅綠假單胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83核酸及蛋白序列的生物信息學(xué)分析53-54
• 1.3 結(jié)果54-66
• 1.3.1 銅綠假單胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83基因克隆表達(dá)與鑒定54-59
• 1.3.2 銅綠假單胞菌外膜蛋白 OprF190 342-OprI21 83基因及蛋白序列生物信息學(xué)分析59-66
• 1.4 討論66-68
• 1.5 小結(jié)68-69
• 第二章 生物可降解多糖微球載體疫苗的制備及體外評價69-83
• 2.1 材料70-71
• 2.1.1 主要藥品和試劑70
• 2.1.2 儀器和設(shè)備70
• 2.1.3 試劑的配制70-71
• 2.2 方法71-74
• 2.2.1 甘露糖修飾的殼聚糖衍生物的制備71
• 2.2.2 殼聚糖和甘露糖修飾的殼聚糖微球載體疫苗的制備及體外評價71-72
• 2.2.3 殼聚糖和甘露糖修飾的殼聚糖包衣的 PLGA 微球載體疫苗的制備及體外評價72-73
• 2.2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析73-74
• 2.3 結(jié)果74-80
• 2.3.1 甘露糖修飾的殼聚糖衍生物的獲得74
• 2.3.2 殼聚糖和甘露糖修飾的殼聚糖微球載體疫苗的表征74-77
• 2.3.3 殼聚糖和甘露糖修飾的殼聚糖包衣的 PLGA 微球載體疫苗的表征77-80
• 2.4 討論80-81
• 2.5 小結(jié)81-83
• 第三章 生物可降解多糖微球載體疫苗在巨噬細(xì)胞中的攝取及其靶向性研究83-95
• 3.1 材料83-85
• 3.1.1 實驗細(xì)胞株和動物83
• 3.1.2 主要藥品和試劑83-84
• 3.1.3 儀器和設(shè)備84
• 3.1.4 試劑的配制84-85
• 3.2 方法85-88
• 3.2.1 生物可降解多糖微球載體疫苗在巨噬細(xì)胞中的攝取85-86
• 3.2.2 FI-MCS-MPs 和 FI-MCP-MPs 靶向巨噬細(xì)胞甘露糖受體研究86-88
• 3.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析88
• 3.3 結(jié)果88-92
• 3.3.1 生物可降解多糖微球載體疫苗在巨噬細(xì)胞中的攝取88-90
• 3.3.2 FI-MCS-MPs 和 FI-MCP-MPs 靶向巨噬細(xì)胞甘露糖受體研究90-92
• 3.4 討論92-94
• 3.5 小結(jié)94-95
• 第四章 巨噬細(xì)胞甘露糖受體介導(dǎo)甘露糖修飾的多糖微球載體疫苗促進(jìn) MAPK 和 NF-κB 信號通路的活化95-115
• 4.1 材料95-97
• 4.1.1 實驗細(xì)胞株95-96
• 4.1.2 主要藥品和試劑96
• 4.1.3 儀器和設(shè)備96
• 4.1.4 試劑的配制96-97
• 4.2 方法97-99
• 4.2.1 小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 的培養(yǎng)97-98
• 4.2.2 MTT 方法檢測生物可降解多糖微球載體疫苗對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 的毒性作用98
• 4.2.3 巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的測定98
• 4.2.4 信號通路細(xì)胞蛋白的提取及 Western blot 檢測98-99
• 4.2.5 信號通路蛋白 Western blot 檢測99
• 4.2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析99
• 4.3 結(jié)果99-111
• 4.3.1 生物可降解多糖微球載體疫苗對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7的毒性作用99-101
• 4.3.2 生物可降解多糖微球載體疫苗對巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響101-103
• 4.3.3 生物可降解多糖微球載體疫苗對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響103-107
• 4.3.4 物可降解多糖微球載體疫苗對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響107-111
• 4.4 討論111-112
• 4.5 小結(jié)112-115
• 第五章 生物可降解多糖微球載體疫苗在小鼠中的黏膜免疫效果評價及安全性效力評價115-137
• 5.1 材料116
• 5.1.1 實驗動物和菌株116
• 5.1.2 主要藥品和試劑116
• 5.1.3 儀器和設(shè)備116
• 5.1.4 試劑的配制116
• 5.2 方法116-120
• 5.2.1 實驗動物免疫程序116-117
• 5.2.2 黏膜和系統(tǒng)體液免疫應(yīng)答的影響117-119
• 5.2.3 黏膜和系統(tǒng)中 T 淋巴細(xì)胞亞群水平的影響119
• 5.2.4 肺臟脾臟 T 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清 IFN-γ和 IL-4 細(xì)胞因子測定119-120
• 5.2.5 生物可降解多糖微球載體疫苗對小鼠攻毒保護(hù)效果研究120
• 5.2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析120
• 5.3 結(jié)果120-132
• 5.3.1 黏膜和系統(tǒng)體液免疫應(yīng)答的影響120-125
• 5.3.2 黏膜和系統(tǒng)中 T 淋巴細(xì)胞亞群水平的影響125-130
• 5.3.3 肺臟脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清 IFN-γ和 IL-4 細(xì)胞因子測定130-131
• 5.3.4 生物可降解多糖微球載體疫苗對小鼠攻毒保護(hù)效果研究131-132
• 5.4 討論132-134
• 5.5 小結(jié)134-137
• 第六章 生物可降解多糖微球載體疫苗在水貂中的黏膜免疫效果評價及安全性效力評價137-145
• 6.1 材料138
• 6.1.1 實驗動物和菌株138
• 6.1.2 主要藥品和試劑138
• 6.1.3 儀器和設(shè)備138
• 6.1.4 試劑的配制138
• 6.2 方法138-140
• 6.2.1 實驗動物免疫程序138-139
• 6.2.2 血清中 FI 特異性抗體的檢測139
• 6.2.3 生物可降解多糖微球載體疫苗對水貂攻毒保護(hù)效果研究139-140
• 6.2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析140
• 6.3 結(jié)果140-142
• 6.3.1 血清中 FI 特異性抗體的檢測140-141
• 6.3.2 生物可降解多糖微球載體疫苗對水貂攻毒保護(hù)效果研究141-142
• 6.4 討論142-144
• 6.5 小結(jié)144-145
• 結(jié)論145-146
• 創(chuàng)新點146-147
• 參考文獻(xiàn)147-163
• 導(dǎo)師簡介163-164
• 個人簡介164-165
• 在學(xué)期間所取得的科研成果165-166
• 致謝166

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李建秀,俞鎮(zhèn)慌;完全生物降解材料的應(yīng)用及發(fā)展趨勢[J];產(chǎn)業(yè)用紡織品;2003年09期

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  本文關(guān)鍵詞：甘露糖受體介導(dǎo)的多糖重組抗原銅綠假單胞菌疫苗的研制及其免疫分子機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：424154