本文關(guān)鍵詞：2008-2013年華東地區(qū)新城疫病毒分子流行病學(xué)及HN基因E347K變異對(duì)病毒抗原性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)強(qiáng)毒引起的一種烈性傳染病,對(duì)全球養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。NDV屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科的禽腮腺炎病毒屬,是一種單股、負(fù)鏈有囊膜的RNA病毒。其基因組長(zhǎng)度約為15.2Kb,基因組結(jié)構(gòu)模式為3’-NP-P-M-F-HN-L-5'依次編碼6種蛋白：核衣殼蛋白(Nucleocapsid Protein, NP)、磷蛋白(Phosphate Protein, P)、基質(zhì)蛋白(Matrix Protein,M)、融合蛋白(Fusion Protein, F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-Neuraminidase Protein, HN)和大分子蛋白(Large Polymerase Protein, L)。自上世紀(jì)90年代早期出現(xiàn)以來(lái),基因Vlld亞型NDV已經(jīng)成為我國(guó)優(yōu)勢(shì)流行基因型。研究表明,基因VIld亞型新城疫病毒HN基因E347K變異會(huì)增大其與疫苗株的抗原性差異,但這種變異株的流行情況尚不清楚。此外,目前缺乏對(duì)活禽市場(chǎng)雞群中弱毒NDV流行情況的數(shù)據(jù)。為此我們對(duì)2008-2013年華東地區(qū)新城疫病毒進(jìn)行分子流行病學(xué)研究,以進(jìn)一步闡明華東地區(qū)強(qiáng)毒NDV的流行情況,以及活禽市場(chǎng)中弱毒NDV的流行情況。同時(shí),選取自1997-2013年分離自江蘇地區(qū)的基因Vlld亞型NDV進(jìn)行全基因組序列分析,以闡明本地區(qū)基因Vlld亞型NDV的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)。我們還對(duì)HN基因在疫苗的保護(hù)性中的作用及HN基因E347K變異對(duì)病毒抗原性的影響進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)疫苗株與攻擊強(qiáng)毒抗原性匹配程度對(duì)疫苗保護(hù)作用有很大影響,而HN基因E347K變異是產(chǎn)生抗原性差異的重要原因。1.2008-2013年華東地區(qū)新城疫病毒分子流行病學(xué)研究本研究對(duì)2008-2013年從華東地區(qū)分離的新城疫病毒進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。從臨床病料中共分離到75株NDV,這些NDV具有不同的宿主來(lái)源,主要來(lái)自鴨源、鵝源和雞源；從華東地區(qū)活禽市場(chǎng)中共分離到247份ND陽(yáng)性樣品,分離率為3.48%,其中class I陽(yáng)性樣品為236份,陽(yáng)性率為3.32%,獲得class I NDV34株,class II日性樣品經(jīng)鑒定均為疫苗株LaSota或者V4。2008-2010年在華東地區(qū)臨床樣品中未檢測(cè)到強(qiáng)毒NDV,2011-2013年分離到55株基因Vlld亞型NDV,這55株基因Vlld亞型NDV可以進(jìn)一步分為Ⅶd1(3/55)和Ⅶd2(52/55)亞型兩個(gè)分支,3株基因Ⅶd1亞型分離株均為2011年分離,2012-2013年分離株均屬于Ⅶd2亞型。39/55株基因Vlld亞型NDV分離株的F基因發(fā)生K78R變異。對(duì)HN基因線性表位及其周圍的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),38/55株基因Ⅶd亞型NDV發(fā)生E347K變異,并同時(shí)發(fā)生G362A變異。此外,疫苗保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明,LaSota株并不能有效降低排毒率及排毒量。在活禽市場(chǎng)共分離34株class I新城疫病毒,21株為雞源,13株為水禽源,分離株中除了CK/JS/03/09和CK/JS/02/10兩株病毒外,其余的2008-2010分離的毒株均與D/ZJ/26/05和D/JS/1/07處于同一個(gè)小分支,屬于3b亞型,其余均為3c亞型。我們監(jiān)測(cè)結(jié)果表明,華東地區(qū)基因Vlld亞型NDVHN基因E347K變異株已成為流行優(yōu)勢(shì)：活禽市場(chǎng)class I毒株出現(xiàn)新的3c亞型,而且已經(jīng)發(fā)生由水生禽類向陸生禽類的跨種間傳播,因此有必要對(duì)其進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。2.江蘇地區(qū)基因Ⅶd亞型新城疫病毒進(jìn)化動(dòng)力學(xué)研究本研究對(duì)從1997-2013年從江蘇地區(qū)分離的25株基因Ⅶd亞型NDV進(jìn)行全基因組序列分析。根據(jù)6個(gè)基因及全基因組核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化發(fā)生樹(shù)高度一致,分為Ⅶd1和Ⅶd2兩個(gè)亞型。通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),NP基因有3個(gè)位點(diǎn)存在差異,其中2011。2013年分離株與之前的分離株相比發(fā)生T2201變異；P基因有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異,其中2011-2013年分離株與之前的分離株相比發(fā)生G320E和R380K變異；M基因有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化；F基因有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化,其中2011-2013年分離株與之前的分離株相比發(fā)生K78R變異；HN基因有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化,其中2011-2013年分離株與之前的分離株相比發(fā)生E347K和G362A變異；L基因有8個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化。使用貝葉斯估算方法對(duì)6個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)化速率分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示基因Ⅶd亞型NDV的6個(gè)基因的進(jìn)化速率分別是：NP基因?yàn)?.18×10-3；P基因?yàn)?.47×10-4；M基因?yàn)?.00×10-3：F基因?yàn)?.25×10-3；HN基因?yàn)?.24×10-3；L基因?yàn)?.16×10-3核苷酸替代／位點(diǎn)/年。進(jìn)化率計(jì)算結(jié)果顯示江蘇地區(qū)基因Ⅶd亞型NDV的平均進(jìn)化速率為1.06x 10-3核苷酸替代／位點(diǎn)／年(9.03×1-4～1.25×10-3替代／位點(diǎn)／年),基于拼接的基因組序列BSP分析方法推測(cè)基因Ⅶd亞型NDV最早應(yīng)該出現(xiàn)在1991年左右�？傊�,本研究基因?qū)Β鱠亞型NDV的進(jìn)化規(guī)律進(jìn)行了揭示。3.HN基因變異對(duì)疫苗保護(hù)性的影響新城疫疫苗免疫目前是防控NDV的一種重要途徑。F和HN是NDV的兩個(gè)表面囊膜糖蛋白,均對(duì)病毒的抗原性存在顯著影響。目前,大量研究表明F糖蛋白對(duì)疫苗的保護(hù)性起主要作用。本研究通過(guò)反向遺傳技術(shù),對(duì)HN基因在疫苗保護(hù)性中的作用進(jìn)行研宄。本研究通過(guò)在基因Ⅶd亞型疫苗候選株A14骨架上替換流行株JS-16-12-Ch的HN基因,構(gòu)建并拯救新候選疫苗株O/A14,比較A14、O/A14及LaSota株三者用流行株攻擊時(shí)保護(hù)力差異。將三個(gè)疫苗株與JS-16-12-Ch進(jìn)行交叉中和及交叉血凝抑制試驗(yàn),結(jié)果表明A14株和LaSota株與JS-16-12-Ch株存在顯著抗原性差異,而O/A14株與JS-16-12-Ch的抗原性差異不顯著。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明,O/A14免疫組喉頭及泄殖腔排毒率顯著低于A14及LaSota免疫組。攻毒后3天喉頭棉拭病毒定量結(jié)果表明,O/A14免疫組顯著低于A14及LaSota免疫組。對(duì)攻毒后3天部分臟器進(jìn)行病理學(xué)觀察及病毒定量,病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),O/A14免疫組及A14免疫組病變程度相似,均輕于LaSota免疫組,而O/A14免疫組胸腺、腎臟和肺的病毒載量顯著低于A14及LaSota免疫組。我們的研究結(jié)果表明,疫苗株的HN基因?qū)σ呙绲谋Ｗo(hù)性具有重要的作用,其與流行株的抗原性匹配程度決定了免疫禽群的排毒率及排毒量。4.HN基因E347K及G362A變異對(duì)病毒抗原性影響的研究流行病學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明基因Ⅶd亞型NDV HN基因E347K變異株在華東地區(qū)已經(jīng)成為優(yōu)勢(shì)流行株。同時(shí),研究表明HN基因通過(guò)某些位點(diǎn)的改變,對(duì)病毒抗原性造成顯著影響,進(jìn)而對(duì)疫苗的保護(hù)性造成影響。本研究在基因Ⅶd亞型新城疫病毒JS-5-05-Go (14)骨架上對(duì)其HN基因進(jìn)行E347K單點(diǎn)突變拯救點(diǎn)突變病毒347/14株,G362A單點(diǎn)突變拯救點(diǎn)突變病毒362/14株以及E347K、G362A雙點(diǎn)突變拯救點(diǎn)突變病毒347+362/14株。通過(guò)交叉血清學(xué)試驗(yàn),對(duì)突變后的病毒與母本病毒的抗原性差異進(jìn)行評(píng)價(jià),初步說(shuō)明這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)病毒抗原性的影響。我們將14株的HN基因表達(dá)至雞痘病毒FPV)中,構(gòu)架重組雞痘病毒rFPV-HN,純化后免疫SPF雞,分別用三個(gè)點(diǎn)突變病毒及母本病毒攻毒,對(duì)排毒率、排毒量及病理學(xué)變化進(jìn)行比較,進(jìn)一步闡釋E347K和G362A變異對(duì)病毒抗原性的影響。交叉中和試驗(yàn)結(jié)果表明兩個(gè)347/14及347+362/14株與母本病毒14株的中和試驗(yàn)R值均為0.38,而362/14株與14株的中和試驗(yàn)R值為0.65,說(shuō)明347/14及347+362/14株與母本病毒14株存在顯著抗原性差異,而362/14株則存在較小的抗原性差異。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明,347/14、362/14及347+362/14攻毒組泄殖腔排毒率均顯著高于14攻毒組,對(duì)攻毒后3天喉頭排毒進(jìn)行病毒定量,結(jié)果表明,347/14、347+362/14攻毒組排毒量顯著高于14攻毒組,而362/14與14及347/14與347+362/14攻毒組不存在顯著性差異。組織病理學(xué)觀察表明,34736/142組的組織病變重于347/14組,而362/14組及14組的病變最輕。同時(shí),對(duì)部分組織臟器的病毒定量結(jié)果與喉頭棉拭定量結(jié)果相一致,347+362/14組和347/14組組織病毒載量均顯著高于未突變的14組,而362/14組僅在法氏囊與14株存在顯著性差異,347+362/14組和347/14組不存在顯著差異。我們的研究結(jié)果表明,HN基因E347K變異會(huì)對(duì)病毒抗原性造成顯著性影響,而G362A變異對(duì)病毒抗原性影響較為有限,而E347K及G362A雙突變對(duì)病毒抗原性影響存在部分協(xié)同作用,會(huì)進(jìn)一步增大抗原性差異,但并未顯著高于E347K變異。
【關(guān)鍵詞】：新城疫病毒 基因Ⅶd亞型 3c亞型 HN基因 E347K變異 抗原性差異
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 符號(hào)說(shuō)明12-14
• 綜述 新城疫病毒分子流行病學(xué)研究進(jìn)展14-37
• 參考文獻(xiàn)27-37
• 第一章 2008-2013年華東地區(qū)新城疫病毒分子流行病學(xué)研究37-66
• 1 材料38-39
• 2 方法39-43
• 3 結(jié)果43-58
• 4 討論58-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 第二章 江蘇地區(qū)基因Ⅶd亞型新城疫病毒進(jìn)化動(dòng)力學(xué)研究66-89
• 1 材料67-68
• 2 方法68-71
• 3 結(jié)果71-81
• 4 討論81-84
• 參考文獻(xiàn)84-89
• 第三章 HN基因?qū)σ呙绫Ｗo(hù)性影響的研究89-109
• 1 材料90-91
• 2 方法91-95
• 3 結(jié)果95-102
• 4 討論102-105
• 參考文獻(xiàn)105-109
• 第四章 HN基因E347K及G362A變異對(duì)病毒抗原性影響的研究109-130
• 1 材料109-111
• 2 方法111-117
• 3 結(jié)果117-124
• 4 討論124-126
• 參考文獻(xiàn)126-130
• 全文小結(jié)130-131
• 致謝131-132
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文132-133

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