本文關(guān)鍵詞：奶牛瓣胃上皮細(xì)胞對(duì)小肽的吸收機(jī)制及小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1的特征研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小肽是奶牛的重要氮源和牛奶中乳蛋白形成的重要前體物,并且能被胃腸道大量吸收。本研究圍繞奶牛瓣胃上皮細(xì)胞(Omasal epithelial cells, OEC)及小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1 (Peptide transporter 1, PepT1),探索瓣胃及PepT1吸收小肽的機(jī)制。首先,成功建立了奶牛OEC體外培養(yǎng)模型；其次,研究了OEC對(duì)小肽攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)PepTl在奶牛OEC吸收小肽過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；最后,比對(duì)分析了奶牛PepT1 (bovine PepT1, bPepT1)的結(jié)構(gòu)特征,并對(duì)其表達(dá)功能特征和分布規(guī)律進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：1.奶牛OEC體外培養(yǎng)模型的建立及其功能檢測(cè)該部分旨在建立奶牛OEC體外培養(yǎng)模型。瓣胃組織取自4頭新生的中國(guó)荷斯坦?fàn)倥?采用2.5%胰蛋白酶連續(xù)消化分離得到游離細(xì)胞,將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%血清、10ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、5μg/mL胰島素、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、50μg/mL慶大霉素和2.5 μg/mL兩性霉素B的DMEM高糖培養(yǎng)基中,通過(guò)HE組織染色發(fā)現(xiàn)瓣胃上皮層已完全被消化酶分離下來(lái)。利用酶差消化法和相差貼壁法對(duì)OEC進(jìn)行純化,純化后的OEC呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞鋪路石狀形態(tài)特征,純度達(dá)90%以上。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)到上皮細(xì)胞內(nèi)角蛋白CKl8和PepT1的表達(dá),通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR方法在上皮細(xì)胞中檢測(cè)到存在PepT1的mRNA表達(dá),通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察到上皮細(xì)胞表面存在微絨毛,并且在細(xì)胞間有橋粒、緊密連接結(jié)構(gòu)、基底層折疊和張力細(xì)絲等典型上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)出現(xiàn),并存在極化現(xiàn)象；細(xì)胞具有典型的“S”型細(xì)胞增長(zhǎng)曲線,且至少可傳至10代。通過(guò)對(duì)OEC攝取2.5 mM二肽glycylsarcosine (Gly-Sar,甘氨酸-肌氨酸)功能進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OEC可完整地?cái)z取Gly-Sar并呈現(xiàn)pH依賴性(最佳pH 5.5-6.5)、時(shí)間依賴性(在10 min時(shí)達(dá)到飽和)、濃度依賴性和溫度依賴性；此外還發(fā)現(xiàn)Gly-Sar在濃度較低時(shí)(1.5 mM),通過(guò)PepT1載體途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)量較大,說(shuō)明低濃度小肽存在時(shí)PepTl更易發(fā)揮作用。另外,這種攝取可以被Met-Gly二肽競(jìng)爭(zhēng)性的抑制,而不被游離氨基酸(Free amino acid, FAA)抑制。綜上所述,OEC體外培養(yǎng)模型已成功建立,并且PepT1在其攝取小肽過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,所培養(yǎng)的OEC可以作為體外研究瓣胃小肽吸收功能的模型。2. PepTl在奶牛OEC吸收二肽中的功能及影響因素該部分旨在研究奶牛OEC對(duì)Gly-Sar的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及其影響因素,探討PepTl基因在OEC吸收小肽過(guò)程中發(fā)揮的作用。免疫熒光化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鋪滿的OEC細(xì)胞層有緊密連接蛋白(ZO-1和閉合蛋白)的表達(dá),尤其在細(xì)胞連接處表達(dá)量更多；檢測(cè)鋪于Transwell濾膜OEC細(xì)胞層的電阻值和滲透性發(fā)現(xiàn)細(xì)胞層的電阻值在一周時(shí)達(dá)到平臺(tái)期,熒光素鈉的滲透率為0.63%,顯著低于對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞組,12%),說(shuō)明細(xì)胞層已緊密形成,可以進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。通過(guò)控制孵育細(xì)胞的溫度、pH、時(shí)間、濃度、二乙烯焦碳酸酯(DEPC)和競(jìng)爭(zhēng)肽及LPS的存在與否等不同條件,檢測(cè)下室中的小肽量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OEC在37℃時(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著高于4℃(P0.05),并具有pH依賴性,OEC對(duì)Gly-Sar的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)可以被PepTl的His殘基抑制劑DEPC顯著抑制(P0.05),也可被其他競(jìng)爭(zhēng)性二肽抑制(P0.05),但不被FAA抑制；從上室轉(zhuǎn)運(yùn)到下室的小肽量為反方向的3倍,說(shuō)明小肽轉(zhuǎn)運(yùn)存在方向性。另外,siRNA特異性的干擾OEC的PepTl基因表達(dá)可顯著降低其對(duì)Gly-Sar的吸收(P0.05),然而過(guò)表達(dá)OEC的PepTl可以顯著增加Gly-Sar的吸收(P0.05)；此外結(jié)果還發(fā)現(xiàn)不同種類(Gly-Sar、Lys-Lys和Met-Lys)和不同濃度(0.25 mM、2.5 mM和10 mM)的小肽可顯著提高OEC的PepT1蛋白表達(dá)量(P0.05)。此外,結(jié)果還發(fā)現(xiàn)LPS可以上調(diào)PepT1基因的表達(dá),降低膜電阻,增加OEC對(duì)小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)量；另外,通過(guò)對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞層與OEC細(xì)胞層的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)瓣胃上皮的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力顯著高于瘤胃。綜上所述,PepT1基因可能在奶牛OEC吸收小肽過(guò)程中起著重要作用,并受LPS的影響。3.奶牛PepT1的功能表達(dá)和分布規(guī)律通過(guò)對(duì)克隆的全長(zhǎng)奶牛bPepT1氨基酸序列與其他25個(gè)物種進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)bPepT1與其他物種PepT1的氨基酸序列具有較高的同源性,同源性由高到低依次為山羊(96.2%)、綿羊(95.2%)、馬(85.9%)、豬(85.6%)、狗(83.4%)、人(83.0%)、鼠類(82%-83%)、猴類(81%-83%)、兔(78.6%)、禽類(64%)、魚(yú)類(56%-61%)；奶牛bPepT1蛋白結(jié)構(gòu)中含有12個(gè)跨膜區(qū)、2個(gè)PKA位點(diǎn)、4個(gè)PKC位點(diǎn)和6個(gè)N連接糖基化位點(diǎn),并且在跨膜區(qū)9和10間存在一個(gè)大胞外環(huán)。利用Western blot分析了奶牛bPepTl的胃腸道組織分布規(guī)律,發(fā)現(xiàn)空腸和回腸的bPepT1蛋白表達(dá)量顯著高于其他部位(P0.05),表達(dá)量最低的部位為瘤胃,奶牛bPepT1蛋白表達(dá)量從高到低依次為：空腸回腸十二指腸瓣胃瘤胃,說(shuō)明奶牛空腸和回腸可能具有較前胃更強(qiáng)的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力。另外,將真核表達(dá)載體pcDNA3.1/bPepTl轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵母(CHO)細(xì)胞內(nèi),并成功表達(dá)了bPepTl基因和功能,轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞對(duì)0.02 mM同位素標(biāo)記的[3H]-Gly-Sar的攝取在10 min時(shí)達(dá)到飽和,并存在pH依賴性,最佳攝取pH為6.5-7.0(pH梯度為：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)；存在濃度依賴性(濃度梯度為：0.02-10 mM),米氏常數(shù)Km(代表親和力)為0.94±0.06 mM,最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率Vmax為20.80±1.74 nmol/(mg protein·5 min),屬于低親和力高容量載體。通過(guò)檢測(cè)其他16種含Met和Lys等EAA的小肽的IC50(抑制[3H]-Gly-Sar吸收量一半時(shí)所需要抑制肽的濃度,IC50越大表示親和力越小),發(fā)現(xiàn)bPepTl對(duì)不同小肽的親和力不同,其中11種小肽的IC50在0.014-0.096 mM之間(Trp-Phe. Met-Lys、Met-Glu、Gly-Met、Lys-Met、Met-Gly、Gly-Lys、Met-Leu、Lys-Phe、 Met-Met和Met-Leu-Phe),說(shuō)明bPepTl對(duì)這些小肽有很高的親和力；另外4種小肽(Lys-Lys、Leu-Gly-Gly、Lys-Trp-Lys和Met-Gly-Met-Met)的IC50大于2.069mM,說(shuō)明它們不易被bPepT1轉(zhuǎn)運(yùn),其中Lys-Lys幾乎不被轉(zhuǎn)運(yùn)(IC50大于10mM)；此外,在FAA存在時(shí)并沒(méi)有抑制現(xiàn)象。總之,本試驗(yàn)是初次系統(tǒng)研究奶牛bPepT1的表達(dá)功能特點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)bPepT1可廣泛轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽,對(duì)C端含Lys的肽、含正電荷的肽、長(zhǎng)鏈肽不易轉(zhuǎn)運(yùn),并具有種屬特異性。綜上所述,本文成功建立了體外研究奶牛小肽吸收的OEC培養(yǎng)模型,發(fā)現(xiàn)bPepT1在OEC吸收小肽過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,并且奶牛PepT1可廣泛轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽,且有種屬特異性。
【關(guān)鍵詞】：奶牛 瓣胃上皮細(xì)胞 Gly-Sar 小肽 吸收轉(zhuǎn)運(yùn) PepT1 表達(dá)功能
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)一覽表12-14
• 中文摘要14-17
• ABSTRACT17-21
• 第一章 文獻(xiàn)綜述21-51
• 第一節(jié) 小肽的作用及其在反芻動(dòng)物前胃中的吸收21-31
• 1.1 小肽吸收意義21-23
• 1.2 反芻動(dòng)物前胃與門(mén)靜脈小肽數(shù)量23-24
• 1.3 反芻動(dòng)物前胃對(duì)小肽的吸收24-26
• 1.4 小肽吸收機(jī)制26-28
• 1.5 生物活性肽28-31
• 第二節(jié) 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT1)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及分布規(guī)律31-39
• 2.1 PepT1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)31-33
• 2.2 PepT1的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制33
• 2.3 PepT1的克隆表達(dá)33-34
• 2.4 PepT1的底物特異性34-36
• 2.5 PepT1的分布規(guī)律36-39
• 第三節(jié) PepT1表達(dá)和功能的影響因素39-43
• 3.1 疾病39
• 3.2 晝夜節(jié)律39-40
• 3.3 miRNA40
• 3.4 激素40-41
• 3.5 發(fā)育41-42
• 3.6 日糧42-43
• 第四節(jié) 小肽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的研究模型43-49
• 4.1 動(dòng)物模型43
• 4.2 組織模型43-44
• 4.3 刷狀緣膜囊泡44
• 4.4 細(xì)胞系44-46
• 4.5 原代細(xì)胞46-49
• 第五節(jié) 研究目的意義與內(nèi)容49-51
• 5.1 本研究的目的和意義49
• 5.2 本研究的主要內(nèi)容49-51
• 第二章 奶牛瓣胃上皮細(xì)胞(OEC)體外培養(yǎng)模型的建立51-69
• 引言51
• 1 材料51-53
• 1.1 瓣胃組織來(lái)源及取樣51
• 1.2 主要試劑及配制51-52
• 1.3 主要儀器和耗材52-53
• 2 方法53-58
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件53
• 2.2 細(xì)胞原代分離53
• 2.3 蘇木精和伊紅(H&E)組織染色53-54
• 2.4 細(xì)胞純化傳代54
• 2.5 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇54
• 2.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線54-55
• 2.7 OEC超微結(jié)構(gòu)觀察55
• 2.8 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定55
• 2.9 OEC的PepT1基因檢測(cè)55-58
• 3 結(jié)果與分析58-66
• 3.1 原代OEC生長(zhǎng)和形態(tài)觀察58-61
• 3.2 OEC生長(zhǎng)曲線61-62
• 3.3 OEC超微結(jié)構(gòu)觀察62-63
• 3.4 OEC的鑒定和PepT1的檢測(cè)63-65
• 3.5 PepT1引物特異性65-66
• 4 討論66-69
• 第三章 奶牛OEC對(duì)Gly-Sar吸收機(jī)制的研究69-115
• 引言69
• 第一節(jié) 奶牛OEC對(duì)Gly-Sar的胞內(nèi)攝取機(jī)制研究69-81
• 1. 材料69-70
• 1.1 OEC69
• 1.2 試劑69-70
• 1.3 儀器70
• 2 方法70-73
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)70
• 2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和處理70-71
• 2.3 蛋白測(cè)定71-72
• 2.4 底物對(duì)OEC PepT1表達(dá)的影響72
• 2.5 Western blot72-73
• 2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)73
• 3 結(jié)果與分析73-77
• 3.1 OEC對(duì)Gly-Sar攝取的pH和時(shí)間依賴性73-74
• 3.2 OEC對(duì)Gly-Sar攝取的溫度和濃度依賴性74-75
• 3.3 Met-Gly與DEPC對(duì)OEC攝取Gly-Sar的抑制作用75-76
• 3.4 底物對(duì)OEC PepT1表達(dá)的影響76-77
• 4 討論77-81
• 第二節(jié) 奶牛OEC對(duì)Gly-Sar跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究81-101
• 引言81
• 1 材料81
• 1.1 OEC81
• 1.2 試劑81
• 1.3 儀器81
• 2 方法81-86
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)81-82
• 2.2 細(xì)胞層緊密性的檢測(cè)82-83
• 2.3 OEC對(duì)Gly-Sar的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究83-84
• 2.4 LPS對(duì)OEC的PepT1表達(dá)和Gly-Sar轉(zhuǎn)運(yùn)的影響84-85
• 2.5 瘤胃上皮細(xì)胞(REC)與OEC小肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力比較85
• 2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)85-86
• 3 結(jié)果與分析86-97
• 3.1 OEC細(xì)胞層致密性的評(píng)價(jià)86-89
• 3.2 Gly-Sar轉(zhuǎn)運(yùn)的影響因素89-92
• 3.3 LPS對(duì)OEC的PepT1表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響92-94
• 3.4 瘤胃和OEC轉(zhuǎn)運(yùn)Gly-Sar能力比較94-97
• 4 討論97-101
• 4.1 OEC細(xì)胞層結(jié)構(gòu)完整性的評(píng)估97-98
• 4.2 OEC細(xì)胞層對(duì)Gly-Sar轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究98-99
• 4.3 LPS對(duì)OEC的PepT1表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響99-100
• 4.4 REC和OEC轉(zhuǎn)運(yùn)Gly-Sar能力比較100-101
• 第三節(jié) siRNA干擾與過(guò)表達(dá)PepT1對(duì)OEC攝取Gly-Sar的影響101-115
• 1 材料101
• 1.1 細(xì)胞101
• 1.2 試劑101
• 1.3 儀器101
• 2 方法101-105
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)101
• 2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)101-102
• 2.3 siRNA干擾條件的篩選102-103
• 2.4 siRNA干擾對(duì)OEC攝取G砂Sar的影響103
• 2.5 siRNA干擾效果檢測(cè)103
• 2.6 過(guò)表達(dá)PepT1對(duì)OEC攝取Gly-Sar的影響103-105
• 3 結(jié)果與分析105-112
• 3.1 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化105-108
• 3.2 siRNA干擾對(duì)OEC攝取Gly-Sar的影響108-109
• 3.3 過(guò)表達(dá)PepT1對(duì)OEC攝取Gly-Sar的影響109-112
• 4 討論112-115
• 第四章 奶牛小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1的功能特征及組織分布115-151
• 1 材料115
• 1.1 細(xì)胞系115
• 1.2 試劑115
• 1.3 儀器115
• 2 方法115-118
• 2.1 奶牛全長(zhǎng)bPepT1的克隆與真核表達(dá)載體的構(gòu)建115
• 2.2 奶牛bPepT1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)115-116
• 2.3 奶牛bPepT1與其他物種的同源性比較116
• 2.4 奶牛胃腸道bPepT1的分布規(guī)律116
• 2.5 細(xì)胞培養(yǎng)116-117
• 2.6 CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染117
• 2.7 qPCR檢測(cè)bPepT1的表達(dá)117
• 2.8 轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的PepT1表達(dá)功能117-118
• 2.9 液閃移檢測(cè)118
• 2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析118
• 3 結(jié)果與分析118-144
• 3.1 奶牛bPepT1蛋白結(jié)構(gòu)118-135
• 3.2 奶牛胃腸道組織bPepT1的分布規(guī)律135-136
• 3.3 奶牛bPepT1的功能特征136-144
• 4 討論144-151
• 4.1 bPepT1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)144-146
• 4.2 奶牛胃腸道組織bPepT1的分布規(guī)律146
• 4.3 bPepT1的功能特點(diǎn)146-148
• 4.4 bPepT1對(duì)不同小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)研究148-151
• 第五章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與研究展望151-153
• 1 主要結(jié)論151
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)151-152
• 3 研究展望152-153
• 參考文獻(xiàn)153-177
• 作者簡(jiǎn)歷及論文發(fā)表情況177-179
• 致謝179

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 姜寧;張愛(ài)忠;苗樹(shù)君;陳景華;韓華;;補(bǔ)充不同處理蛋氨酸和小肽及對(duì)奶牛產(chǎn)奶性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響[J];中國(guó)牛業(yè)科學(xué);2006年04期

2 李燕;林雪彥;姜運(yùn)良;蘇鵬程;王中華;;應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)牛消化道各段Ⅰ型肽載體mRNA差異表達(dá)的研究[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2008年02期

3 曹志軍,李勝利,丁志民;日糧中添加小肽對(duì)奶牛產(chǎn)奶性能影響的研究[J];飼料工業(yè);2004年04期

4 井龍暉;張瑞陽(yáng);朱偉云;毛勝勇;;頸靜脈灌注脂多糖對(duì)奶牛外周血循環(huán)中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和氨基酸濃度的影響[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年12期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 趙珂;奶牛乳腺上皮細(xì)胞葡萄糖攝取的調(diào)控及其對(duì)乳成分合成的影響研究[D];浙江大學(xué);2011年

2 王崗;綿羊小腸寡肽吸收規(guī)律的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

3 孫冬黎;小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體POTs在前列腺和脾臟及巨噬細(xì)胞的功能性表達(dá)研究[D];浙江大學(xué);2012年

4 于志鵬;蛋清源活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究[D];吉林大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 李燕;牛I型肽載體（BPepT1）的克隆及在消化道組織中的表達(dá)分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

2 戴燕青;穩(wěn)定表達(dá)人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1的細(xì)胞模型構(gòu)建及應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：奶牛瓣胃上皮細(xì)胞對(duì)小肽的吸收機(jī)制及小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1的特征研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：396418