本文關(guān)鍵詞：新型抗菌糖肽-sublancin的增量表達及其生物學活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗生素濫用所造成的殘留已嚴重影響到人類的健康和畜牧業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展,開展抗生素替代品-抗菌肽的研究備受國內(nèi)外的高度關(guān)注。來源于天然抗菌肽及其衍生的雜合抗菌肽因具有高效廣譜的抗病毒、抗真菌、抗細菌及抑制癌細胞等生物學功能,以及在體內(nèi)代謝速度快,無殘留,不破壞正常細胞的完整性和生物學活性等特性,因而,深入開展新型抗菌肽研究的意義十分重大。由于不同來源的抗菌肽結(jié)構(gòu)不同,因而采用化學合成法合成的難易程度也不同。從枯草芽孢桿菌168菌株(Bacillus subtilis 168 strain)中分離而來的新型抗菌糖肽-sublancin,具有2個二硫鍵結(jié)構(gòu)和1個因在翻譯后被再次修飾而形成的S-連接糖基團結(jié)構(gòu)。sublancin因具有特殊結(jié)構(gòu)而導致其不易通過正常的化學合成法來合成。通過對sublancin來源菌在染色體水平上進行改造來提高sublancin產(chǎn)率是一個可大量獲取sublancin的可行方法。在本研究中,選用枯草芽孢桿菌168菌株(也含有合成sublancin成熟肽相關(guān)基因的枯草芽孢桿菌1A747菌株)作為sublancin增量表達的出發(fā)菌株。為了提高新型糖肽-sublancin的產(chǎn)率,本研究中在染色體水平上構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌1A747菌株(被命名為枯草芽孢桿菌ZQSY菌株),并通過響應(yīng)面方法在搖瓶水平上對重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。隨后測定了經(jīng)純化的sublancin對一些常見致病菌的抑菌活性和在特定條件下的穩(wěn)定性。最后,應(yīng)用sublancin對動物模型—昆明小鼠的口服急性毒性試驗和生物利用度試驗,評估了sublancin經(jīng)口服飼喂試驗動物后可能存在的風險。本研究結(jié)果如下:1、采用化學法合成了3條與形成sublancin成熟肽相關(guān)的基因(串)(sun I、sun A和sun T bdb A sun S bdb B),并分別在它們的5’端引入了具有不同轉(zhuǎn)錄特點且轉(zhuǎn)錄活性強的啟動子P43、Pglv和Plux S,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了枯草芽孢桿菌同源重組表達載體p DM036。之后,p DM036同源重組進入枯草芽孢桿菌1A747菌株里的SPβ染色體中得到了可增量表達sublancin的重組枯草芽孢桿菌1A747菌株(將其命名為枯草芽孢桿菌ZQSY菌株),在搖瓶水平上對其進行發(fā)酵,并使用tricine SDS PAGE檢測發(fā)酵液上清蛋白表達情況。結(jié)果表明,在分析泳道3.8 k Da的位置上存在著明顯的蛋白條帶,采用免疫印跡雜交分析試驗(western blotting analysis)驗證了該蛋白確實為sublancin的蛋白條帶。應(yīng)用高效液相反相色譜法(reversed phase high performance liquid chromatography,RP HPLC)及紫外分光光度法分析表明,每升搖瓶發(fā)酵液的上清中可獲得642 mg的sublancin樣品。2、在重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株的基礎(chǔ)上和搖瓶培養(yǎng)條件下,使用響應(yīng)面優(yōu)化法進一步提高sublancin的產(chǎn)率。首先采用Design expert 8.0.5b軟件中的Plackett-Burman模塊篩選對發(fā)酵重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株生產(chǎn)sublancin影響比較大的因子,試驗結(jié)果表明具有顯著作用(P0.05)的影響因子分別為玉米粉、豆粕粉和培養(yǎng)溫度。經(jīng)最陡爬坡試驗后,最終應(yīng)用響應(yīng)面分析中的Box-Behnken Design(BBD)篩選法確定了這3個影響因子的最佳條件:玉米粉28.46 g/L、豆粕粉23.05 g/L、培養(yǎng)溫度為30.9°C。在此培養(yǎng)條件下,sublancin最高產(chǎn)率的理論預測值為887.62 mg/L,與在該條件下對重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株進行培養(yǎng)得到的896.8 mg/L sublancin的實得產(chǎn)率基本吻合。在5 L發(fā)酵罐中,采取搖瓶條件下篩選到的最優(yōu)培養(yǎng)條件對重組菌株進行培養(yǎng),sublancin的產(chǎn)率被進一步提高到了968 mg/L。3、將重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株在5 L發(fā)酵罐中經(jīng)一系列發(fā)酵和純化流程后所得到的sublancin樣品應(yīng)用于后續(xù)試驗之中。抑菌試驗結(jié)果表明,sublancin樣品對化膿性鏈球菌和金黃色葡萄球菌等9種常見的耐藥或非耐藥的指示菌表現(xiàn)出了不同程度的抑菌活性,其中對耐加氧西林金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)為0.4±0.21 mg/L,抑菌效果最顯著。穩(wěn)定性試驗表明,60°C以下的溫度處理30 min對sublancin的抑菌活性影響不明顯,80°C以上溫度處理30 min會顯著降低sublancin的抑菌活性。p H波動范圍在4.0~9.0時sublancin的抑菌活性可穩(wěn)定維持在較高水平,當p H≤4.0時sublancin的抑菌活性顯著下降。在胃蛋白酶、人中性粒細胞彈性蛋白酶、銅綠假單胞菌彈性蛋白酶、金黃色葡萄球菌V8蛋白酶和胰蛋白酶的作用下,sublancin的抑菌活性幾乎不受影響。4、以昆明小鼠為動物試驗?zāi)Ｐ?對sublancin可能會在動物體內(nèi)所產(chǎn)生的危害進行了初步檢測。Sublancin對雌雄各半的昆明小鼠口服急性毒性試驗的試驗結(jié)果表明,sublancin單次口服劑量不高于5000 mg/kg/d時不會對昆明小鼠包括胃臟在內(nèi)的內(nèi)臟器官造成傷害,也不會引起體內(nèi)受檢測的血液生化指標發(fā)生超正常范圍的變化。生物利用度試驗的結(jié)果表明,sublancin不會以其完整形式進入昆明小鼠體內(nèi)。這些結(jié)果表明sublancin經(jīng)口服進入試驗動物胃腸道內(nèi)給動物健康生產(chǎn)造成安全風險的可能性很低。
【關(guān)鍵詞】：sublancin 抗菌糖肽 枯草芽孢桿菌 產(chǎn)率 抑菌活性
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S859.79
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 上篇 文獻綜述13-41
• 第一章 抗菌肽的研究現(xiàn)狀與進展13-32
• 1.1 抗菌肽的發(fā)現(xiàn)13-14
• 1.2 抗菌肽的來源及種類14-22
• 1.2.1 具有螺旋結(jié)構(gòu)的線性抗菌肽15-16
• 1.2.2 富含特定氨基酸的線性抗菌肽16-17
• 1.2.3 具有一個二硫鍵的抗菌肽17
• 1.2.4 具有兩個或多個二硫鍵的抗菌肽17-18
• 1.2.5 含羊毛硫及其它結(jié)構(gòu)的抗菌肽18
• 1.2.6 合成sublancin的相關(guān)基因及其結(jié)構(gòu)特點18-22
• 1.3 抗菌肽的作用特點22-24
• 1.4 抗菌肽的作用機制24-28
• 1.5 抗菌肽在不同領(lǐng)域的應(yīng)用前景及其存在的問題28-32
• 1.5.1 抗菌肽在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用28-29
• 1.5.2 抗菌肽在食品防腐領(lǐng)域的應(yīng)用29
• 1.5.3 抗菌肽在農(nóng)業(yè)病害防控領(lǐng)域的應(yīng)用29-31
• 1.5.4 抗菌肽在應(yīng)用中所存在的問題31-32
• 第二章 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)32-41
• 2.1 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的特點及研究進展32
• 2.2 基因在枯草芽孢桿菌中表達所需的組件32-33
• 2.2.1 多 δ 因子32
• 2.2.2 啟動子32-33
• 2.2.3 終止子33
• 2.3 蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌中的分泌33-35
• 2.4 枯草芽孢桿菌提高基因表達量的影響因素35-37
• 2.4.1 密碼子的選取36
• 2.4.2 目的基因的拷貝數(shù)36
• 2.4.3 載體的選用36
• 2.4.4 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件36-37
• 2.4.5 啟動子的強弱37
• 2.4.6 翻譯起始的效率37
• 2.5 枯草芽孢桿菌表達體系中所存在的問題及發(fā)展方向37-38
• 2.6 本研究的目的和意義38-40
• 2.7 本研究的技術(shù)路線40-41
• 下篇 試驗研究41-81
• 第三章 新型抗菌糖肽SUBLANCIN在枯草芽孢桿菌里的增量表達41-51
• 3.1 引言41
• 3.2 材料和方法41-45
• 3.2.1 重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株的構(gòu)建41-43
• 3.2.2 總RNA的分離和實時定量PCR43-44
• 3.2.3 蛋白雜交44
• 3.2.4 sublancin的純化44-45
• 3.3 結(jié)果45-49
• 3.3.1 重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株的構(gòu)建45
• 3.3.2 重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株的搖瓶水平發(fā)酵45
• 3.3.3 sublancin成熟肽的增量生物合成45-49
• 3.4 討論49-50
• 3.5 小結(jié)50-51
• 第四章 響應(yīng)面法提升重組枯草芽孢桿菌ZQSY菌株合成SUBLANCIN的產(chǎn)率分析51-65
• 4.1 引言51
• 4.2 材料和方法51-57
• 4.2.1 材料51
• 4.2.2 細菌菌株和發(fā)酵條件51-52
• 4.2.3 碳源和氮源的篩選52
• 4.2.4 Plackett-Burman設(shè)計52-55
• 4.2.5 最陡爬坡試驗55
• 4.2.6 響應(yīng)面試驗方法55-56
• 4.2.7 使用 5 L發(fā)酵罐進行分批發(fā)酵試驗56-57
• 4.2.8 數(shù)據(jù)處理方法57
• 4.3 結(jié)果與討論57-64
• 4.3.1 最優(yōu)碳源和氮源的篩選57
• 4.3.2 Plackett-Burman設(shè)計57-59
• 4.3.3 最陡爬坡試驗59
• 4.3.4 Box-Behnken設(shè)計59-61
• 4.3.5 搖瓶水平上的模型驗證61-62
• 4.3.6 發(fā)酵罐水平的模型驗證62
• 4.3.7 玉米粉和豆粕粉對sublancin產(chǎn)率的影響62-64
• 4.4 小結(jié)64-65
• 第五章 SUBLANCIN的結(jié)構(gòu)分析及生物學活性與穩(wěn)定性測定65-74
• 5.1 引言65
• 5.2 材料與方法65-67
• 5.2.1 sublancin二級結(jié)構(gòu)分析65
• 5.2.2 sublancin的抑菌活性試驗65-66
• 5.2.3 sublancin對HT-29細胞的裂解活性66
• 5.2.4 sublancin穩(wěn)定性測定66-67
• 5.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析67
• 5.3 結(jié)果67-71
• 5.3.1 sublancin結(jié)構(gòu)分析67-69
• 5.3.2 sublancin在不同條件下的穩(wěn)定性測定69-71
• 5.3.3 sublancin對多種細菌的抑菌活性和細胞毒性71
• 5.4 討論71-73
• 5.5 小結(jié)73-74
• 第六章 SUBLANCIN對昆明小鼠的.服毒性評估74-81
• 6.1 引言74
• 6.2 材料與方法74-77
• 6.2.1 sublancin樣品準備74
• 6.2.2 試驗動物74
• 6.2.3.服急性毒性試驗74-77
• 6.2.4.服生物利用度77
• 6.2.5 血液樣品中sublancin濃度的測定77
• 6.2.6 統(tǒng)計分析77
• 6.3 結(jié)果77-79
• 6.3.1.服急性毒性試驗77-79
• 6.3.2.服生物利用度79
• 6.4 討論79-80
• 6.5 小結(jié)80-81
• 研究結(jié)論81-82
• 創(chuàng)新點82-83
• 需要進一步研究的問題83-84
• 參考文獻84-95
• 附錄95-100
• 致謝100-101
• 作者簡介101

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