本文關鍵詞：家蠶后部絲腺基因表達差異的分析與蠶絲性能改良的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：家蠶是鱗翅目泌絲型經(jīng)濟昆蟲,絲腺是合成分泌絲蛋白、決定蠶絲產(chǎn)量和質量的重要組織器官。絲腺具有高效合成絲蛋白的能力,但采用家蠶絲腺生物反應器表達外源蛋白時,至今為止的所有實驗結果都證明外源蛋白的表達量很低,極大多數(shù)僅占繭絲蛋白含量的百分之幾。為了利用具有極強機械性能的黑寡婦蜘蛛牽引絲改良家蠶絲纖維的機械性能,本研究采用蛋白質組學技術和轉錄組學技術研究了家蠶后部絲腺基因表達調控的特征,初步揭示了絲腺高效合成絲蛋白的分子機制,提供了利用絲腺高效表達蜘蛛絲蛋白的方法和策略；本研究采用轉基因技術創(chuàng)建了含有蜘蛛絲蛋白的家蠶品種,極大地改良了蠶絲的機械性能。具體取得的研究結果如下：1.轉錄組學分析揭示了影響蠶絲蛋白合成的代謝通路以秋豐、裸蛹(Nd)和絲膠繭(Nd-s)3個家蠶品種5齡第3天后部絲腺為材料,采用RNA-seq高通量測序的轉錄組研究方法,結果表明Nd和Nd-s這2個低絲量的突變品種中,組成繭絲蛋白基因的表達水平下降,導致絲產(chǎn)量降低；與絲腺生長發(fā)育相關的基因表達下調,阻礙了絲腺的發(fā)育,影響了絲蛋白的正常合成；絲腺組織中合成了大量不成熟的、錯誤折疊的蛋白,造成蛋白質量控制系統(tǒng)和抗氧化代謝等一系列耗能的代謝增加,大量的能量被空耗在用來維持細胞自身的穩(wěn)態(tài)上面,最終影響了絲蛋白的合成代謝。2.蛋白質組學分析揭示了影響蠶絲蛋白合成的代謝通路采用轉錄組學分析相同的實驗材料,用同位素標記定量法(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)蛋白質組學技術進行分析得知,Nd和Nd-s這2個低絲量的突變品種的繭絲關鍵蛋白表達量下降,絲腺發(fā)育相關的蛋白表達下調,絲蛋白合成及信號通路相關的蛋白表達下調,絲蛋白的分泌及運輸途徑相關的蛋白也受到影響,大量的能量被空耗到無效的代謝途徑上,最終影響了絲蛋白的高效合成。3.采用轉基因技術改良了家蠶繭絲的機械性能以piggyBac載體為基礎,根據(jù)黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白設計并成功構建了包含不同重復單元的類MaSp1和MaSp2的系列載體,利用顯微注射的方法,將其整合到家蠶的基因組內,經(jīng)Inverse-PCR、Q-PCR、Western blotting等方法的檢測,證明已成功獲得了16個轉蜘蛛絲基因家蠶品系。這些品系的繭絲的機械性能顯著提高,與野生型對照品種相比,最大應力最高提高71.92%,最大應變提高34.508%,楊氏模量提高57.819%,韌性最高提高131.673%。4.證明了黑寡婦蜘蛛牽引絲的機械性能與其蛋白分子量大小成極顯著的線性關系采用轉基因技術獲得了類黑寡婦蜘蛛Black Widow Spider, Latrodectus hesperus牽引絲MaSpl基因不同長度的分子的轉基因蜘蛛絲家蠶,根據(jù)多個轉基因家系以及雜合型和純化型2種基因型對比研究結果,都證明了分子越長絲的機械性能越好,說明黑寡婦蜘蛛牽引絲的超級性能來源于她的分子長度,暗示了自然界機械性能優(yōu)良的蛋白性絲纖維都采用高度重復的大分子蛋白的策略是生物進化的一種必然結果。綜上所述,本研究通過對秋豐、裸蛹(Nd)和絲膠繭(Nd-s)3個家蠶品種的轉錄組和蛋白質組差異表達譜分析,揭示了絲蛋白高效合成的機制,為改良家蠶絲腺特性,作為生物反應器高效地合成外源蛋白奠定了分子基礎。本研究采用轉基因技術構建了轉蜘蛛絲基因家蠶品種,顯著提高了家蠶繭絲的機械性能,并證明了絲纖維的機械性能與組成其蛋白分子量之間呈極顯著的線性關系,為進一步改良蠶絲質量奠定了堅實的基礎。本研究結果揭示了如果能夠對家蠶絲腺細胞基因表達特征進行改良,能夠提高外源蛋白蜘蛛絲的表達量,同時導入分子量更大的蜘蛛絲基因,就能夠進一步提高蠶絲的機械性能。
【關鍵詞】：家蠶 后部絲腺 轉錄組 蛋白質組 piggyBac 轉基因 黑寡婦蜘蛛牽引絲 纖維機械性能
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S881.2
【目錄】：

• 致謝(Acknowledgements)6-10
• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 第1章 文獻綜述15-36
• 1.1 家蠶絲腺與絲的研究背景15-23
• 1.1.1 絲腺的研究進展15-18
• 1.1.2 家蠶繭絲及其突變品種的研究18-21
• 1.1.3 絲腺的蛋白質組學的研究21-22
• 1.1.4 蠶絲的應用22-23
• 1.2 家蠶轉基因技術研究進展23-26
• 1.3 蜘蛛絲研究進展26-32
• 1.3.1 蜘蛛絲種類、結構及性能研究26-31
• 1.3.2 蜘蛛絲蛋白的表達研究31-32
• 1.3.3 蜘蛛絲的應用前景32
• 1.4 采用轉基因技術改造蠶絲強度的研究進展32-33
• 1.5 研究的目的意義、內容及技術路線33-36
• 1.5.1 研究目的及意義33-34
• 1.5.2 研究內容34-35
• 1.5.3 技術路線35-36
• 第2章 家蠶不同突變品種后部絲腺轉錄組的分析36-62
• 2.1 引言36-37
• 2.2 試驗材料37
• 2.3 試驗方法37-43
• 2.3.1 家蠶后部絲腺的解剖37
• 2.3.2 總RNA的提取37-38
• 2.3.3 轉錄組測序(RNA-seq)38-40
• 2.3.4 生物信息學的分析40-42
• 2.3.5 熒光定量PCR42-43
• 2.4 結果43-58
• 2.4.1 總RNA的提取43-44
• 2.4.2 數(shù)據(jù)的基本分析44-46
• 2.4.3 差異基因的分析46-53
• 2.4.4 差異基因GO(Gene Ontology)的分析53-56
• 2.4.5 差異基因KEGG的分析56-57
• 2.4.6 熒光定量PCR(Q-PCR)分析家蠶后部絲腺主要基因的表達57-58
• 2.5 討論58-62
• 第3章 家蠶不同突變品種后部絲腺蛋白質譜的分析62-89
• 3.1 引言62
• 3.2 試驗材料62
• 3.3 試驗方法62-68
• 3.3.1 家蠶后部絲腺的解剖62
• 3.3.2 蛋白質組的表達譜(iTRAQ)62-66
• 3.3.3 生物信息學分析66-68
• 3.4 結果68-83
• 3.4.1 鑒定質量的評估及蛋白質鑒定68-71
• 3.4.2 差異蛋白質的鑒定71-79
• 3.4.3 差異蛋白功能Gene Ontology(GO)分類的分析79-81
• 3.4.4 差異蛋白KEGG分析81-83
• 3.5 轉錄組及蛋白質組之間的比較分析83-84
• 3.6 討論84-89
• 第4章 轉蜘蛛絲蛋白改良家蠶繭絲機械性能的研究89-146
• 4.1 引言89-90
• 4.2 材料和方法90-110
• 4.2.1 試驗材料90
• 4.2.2 質粒、菌種及主要試劑90-91
• 4.2.3 主要溶液及其配制91-95
• 4.2.4 試驗方法95-110
• 4.3 結果與分析110-144
• 4.3.1 轉基因家蠶類蜘蛛絲載體的設計及組裝110-117
• 4.3.2 陽性轉基因家蠶的篩選與轉基因陽性率統(tǒng)計117-121
• 4.3.3 不同轉基因系家蠶插入位點的分析121-129
• 4.3.4 外源蜘蛛絲蛋白表達鑒定129-132
• 4.3.5 繭絲機械性能的分析132-138
• 4.3.6 重組蜘蛛絲蛋白的大小與機械性能之間的關系138-142
• 4.3.7 共表達重組MaSp1和MaSp2蛋白機械性能分析142-144
• 4.4 討論144-146
• 第5章 全文總結、創(chuàng)新點和研究展望146-149
• 5.1 全文總結146-148
• 5.2 創(chuàng)新點148
• 5.3 研究展望148-149
• 附件149-164
• 參考文獻164-171
• 攻讀博士期間的研究成果171-173
• 博士期間參加的學術會議173

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張陽;趙愛春;陳雪嬌;魯成;向仲懷;;一種新的單根繭絲纖維橫截面積測量方法[J];蠶業(yè)科學;2011年05期

  本文關鍵詞：家蠶后部絲腺基因表達差異的分析與蠶絲性能改良的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：392959