禽流感(Avian Influenza,AI)和新城疫(Newcastle Disease,ND)分別是由禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的,是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)兩大最主要的烈性傳染病,可引起家禽100%發(fā)病和死亡,被世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)和我國農(nóng)業(yè)部分別列為法定報告疫病和一類傳染病。廣東省地處我國東南沿海,擁有溫暖濕潤的氣候、大面積的濕地、發(fā)達的養(yǎng)殖業(yè)和大量的活禽交易市場,這些因素為病毒的傳播提供了有利的條件。為了控制AI和ND的發(fā)生,我們采取了密集的免疫措施,但AI和ND仍然偶有發(fā)生。為了及時了解危害我國廣東省家禽養(yǎng)殖業(yè)AIV和NDV的流行情況,我們在廣東省收集疑似AIV和NDV感染家禽的組織病料,進行病毒分離鑒定,并研究代表毒株對其易感宿主SPF雞的致病性和傳播特性。本研究中,從廣東省各地區(qū)收集疑似AIV和NDV感染家禽的組織病料,共分離鑒定13株H5N6亞型高致病性AIVs(High pathogeni...

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要 Abstract 常用縮寫詞 第一章前言
1.1 研究背景
    1.1.1 禽流感概述
    
1.1.1.1 H5亞型AIVs的流行情況
    
1.1.1.2 H7N9亞型AIVs流行情況
    
1.1.1.3 H9N2亞型AIVs的流行情況
    1.1.2 新城疫概述
    
1.1.2.1 NDV的分類
    
1.1.2.2 NDV的流行情況
    
1.1.2.3 NDV的結(jié)構(gòu)
    1.1.3 AIV與NDV混合感染
    1.1.4 病毒逃逸宿主免疫反應(yīng)
    
1.1.4.1 SOCS3簡介
1.2 研究目的與意義 第二章 廣東省AIV與NDV流行病學(xué)調(diào)查
2.1 引言
2.2 實驗材料
    2.2.1 實驗動物
    2.2.2 主要試劑
    2.2.3 主要儀器
    2.2.4 主要分子生物學(xué)試劑
    2.2.5 分子生物學(xué)軟件
    2.2.6 樣本收集
2.3 實驗方法
    2.3.1 AIV與NDV分離鑒定
    2.3.2 病毒RNA的提取及cDNA合成
    2.3.3 引物設(shè)計與合成
    2.3.4 PCR(Polymerase chain reaction)鑒定及產(chǎn)物的純化
    2.3.5 目的基因的連接轉(zhuǎn)化及序列測定
    2.3.6 序列分析
    2.3.7 H5N6和H7N9亞型HPAIV對SPF雞致病性和水平傳播能力的研究
2.4 結(jié)果與分析
    2.4.1 病毒分離鑒定
    2.4.2 H5N6亞型AIVs的HA與NA基因進化分析
    2.4.3 H7N9亞型AIVs的HA與NA基因進化分析
    2.4.4 H9N2亞型AIVs的HA與NA基因進化分析
    2.4.5 NDVs的F基因進化分析
    2.4.6 H5N6和H7N9亞型HPAIV對SPF雞致病性和傳播性分析
2.5 小結(jié) 第三章 H9N2亞型AIV感染影響vNDV對SPF雞的致病性
3.1 引言
3.2 實驗材料
    3.2.1 毒株
    3.2.2 雞胚及實驗動物
    3.2.3 主要分子生物學(xué)試劑
    3.2.4 主要儀器
    3.2.5 主要分子生物學(xué)軟件
3.3 實驗方法
    3.3.1 病毒EID₅₀的測定
    3.3.2 rGM株LD₅₀的測定
    3.3.3 實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)
    3.3.4 H9N2亞型AIV與vNDV的共感染SPF雞試驗
    3.3.5 肺臟病理切片的制備
    3.3.6 組織中NDV滴度檢測
    3.3.7 NDV排毒情況的檢測
    3.3.8 HI試驗
3.4 結(jié)果與分析
    3.4.1 病毒EID₅₀及LD₅₀的測定
    3.4.2 感染組臨床癥狀和存活狀況的統(tǒng)計
    3.4.3 病理損傷觀察
    3.4.4 攻毒組中NDV組織分布情況
    3.4.5 NDV排毒檢測
    3.4.6 NDV的HI抗體
3.5 小結(jié) 第四章 H9N2亞型AIV與vNDV共感染SPF雞肺臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究
4.1 引言
4.2 實驗材料
    4.2.1 毒株和實驗動物
    4.2.2 主要試劑
    4.2.3 主要儀器
    4.2.4 主要軟件
4.3 實驗方法
    4.3.1 病毒感染及肺臟的采集
    4.3.2 肺臟總RNA的提取
    4.3.3 文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)
    4.3.4 測序評估
    4.3.5 比對統(tǒng)計
    4.3.6 基因統(tǒng)計分析
    4.3.7 DEGs的Heatmap分析
    4.3.8 KEGG Pathway分析
    4.3.9 GO顯著性富集分析
    4.3.10 qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果
4.4 結(jié)果與分析
    4.4.1 樣本的重復(fù)性檢測
    4.4.2 基因表達數(shù)的統(tǒng)計
    4.4.3 DEGs的GO分析
    4.4.4 DEGs的KEGG Pathway分析
    4.4.5 宿主抗病毒反應(yīng)DEGs的聚類分析
    4.4.6 qRT-PCR驗證RNA-Seq結(jié)果
4.5 小結(jié) 第五章 雞SOCS3蛋白在NDV復(fù)制過程中的作用研究
5.1 引言
5.2 實驗材料
    5.2.1 病毒與細胞
    5.2.2 感受態(tài)細胞和載體
    5.2.3 雞胚與實驗動物
    5.2.4 主要試劑
    5.2.5 主要試劑配方
    5.2.6 主要儀器
5.3 實驗方法
    5.3.1 引物設(shè)計
    5.3.2 雞SOCS3基因的組織分布
    5.3.3 蛋白免疫印跡(Western blot)動態(tài)分析NDV體外感染對SOCS3蛋白表達的影響
    5.3.4 雞SOCS3基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達
    
5.3.4.1 雞SOCS3基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
    
5.3.4.2 轉(zhuǎn)染
    
5.3.4.3 重組雞SOCS3蛋白過表達的鑒定
    5.3.5 體外過表達雞SOCS3蛋白對NDV復(fù)制的影響
    5.3.6 siRNA干擾DF-1 細胞中SOCS3基因的表達對NDV復(fù)制的影響
    5.3.7 BAY11-7082 對NDV誘導(dǎo)SOCS3蛋白表達的影響
    5.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析
5.4 結(jié)果與分析
    5.4.1 雞SOCS3蛋白介導(dǎo)NDV感染過程中的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
    5.4.2 雞SOCS3基因的組織分布
    5.4.3 NDV體外感染可誘導(dǎo)雞SOCS3蛋白的表達
    5.4.4 雞SOCS3基因的真核表達
    
5.4.4.1 攜帶雞SOCS3基因的真核表達質(zhì)粒序列測定結(jié)果分析
    
5.4.4.2 熒光顯微鏡下觀察真核表達產(chǎn)物
    
5.4.4.3 重組SOCS3蛋白的Western blot鑒定
    5.4.5 過表達雞SOCS3蛋白對NDV增殖的影響
    5.4.6 siRNA干擾SOCS3基因表達影響NDV在DF-1 細胞上增殖
    5.4.7 干擾DF-1細胞中的SOCS3基因表達可促進干擾素刺激因子的表達
    5.4.8 NDV感染可通過NF-κB信號通路調(diào)控SOCS3蛋白的表達
5.5 小結(jié) 第六章 全文討論和總結(jié)
6.1 全文討論
    6.1.1 AIV與NDV在廣東省流行病學(xué)的分析
    6.1.2 H9N2亞型AIV感染影響v NDV對SPF雞的致病性
    6.1.3 H9N2亞型AIV與NDV共感染SPF雞的肺臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析
    6.1.4 SOCS3蛋白介導(dǎo)NDV復(fù)制過程
6.2 全文總結(jié) 致謝 參考文獻 附錄A：攻讀博士期間發(fā)表文章 附錄B：參加的學(xué)術(shù)會議



本文編號：3914068