禽流感(Avian Influenza,AI)和新城疫(Newcastle Disease,ND)分別是由禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的,是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)兩大最主要的烈性傳染病,可引起家禽100%發(fā)病和死亡,被世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)和我國農業(yè)部分別列為法定報告疫病和一類傳染病。廣東省地處我國東南沿海,擁有溫暖濕潤的氣候、大面積的濕地、發(fā)達的養(yǎng)殖業(yè)和大量的活禽交易市場,這些因素為病毒的傳播提供了有利的條件。為了控制AI和ND的發(fā)生,我們采取了密集的免疫措施,但AI和ND仍然偶有發(fā)生。為了及時了解危害我國廣東省家禽養(yǎng)殖業(yè)AIV和NDV的流行情況,我們在廣東省收集疑似AIV和NDV感染家禽的組織病料,進行病毒分離鑒定,并研究代表毒株對其易感宿主SPF雞的致病性和傳播特性。本研究中,從廣東省各地區(qū)收集疑似AIV和NDV感染家禽的組織病料,共分離鑒定13株H5N6亞型高致病性AIVs(High pathogeni...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要 Abstract 常用縮寫詞 第一章前言
1.1 研究背景
    1.1.1 禽流感概述
    
1.1.1.1 H5亞型AIVs的流行情況
    
1.1.1.2 H7N9亞型AIVs流行情況
    
1.1.1.3 H9N2亞型AIVs的流行情況
    1.1.2 新城疫概述
    
1.1.2.1 NDV的分類
    
1.1.2.2 NDV的流行情況
    
1.1.2.3 NDV的結構
    1.1.3 AIV與NDV混合感染
    1.1.4 病毒逃逸宿主免疫反應
    
1.1.4.1 SOCS3簡介
1.2 研究目的與意義 第二章 廣東省AIV與NDV流行病學調查
2.1 引言
2.2 實驗材料
    2.2.1 實驗動物
    2.2.2 主要試劑
    2.2.3 主要儀器
    2.2.4 主要分子生物學試劑
    2.2.5 分子生物學軟件
    2.2.6 樣本收集
2.3 實驗方法
    2.3.1 AIV與NDV分離鑒定
    2.3.2 病毒RNA的提取及cDNA合成
    2.3.3 引物設計與合成
    2.3.4 PCR(Polymerase chain reaction)鑒定及產物的純化
    2.3.5 目的基因的連接轉化及序列測定
    2.3.6 序列分析
    2.3.7 H5N6和H7N9亞型HPAIV對SPF雞致病性和水平傳播能力的研究
2.4 結果與分析
    2.4.1 病毒分離鑒定
    2.4.2 H5N6亞型AIVs的HA與NA基因進化分析
    2.4.3 H7N9亞型AIVs的HA與NA基因進化分析
    2.4.4 H9N2亞型AIVs的HA與NA基因進化分析
    2.4.5 NDVs的F基因進化分析
    2.4.6 H5N6和H7N9亞型HPAIV對SPF雞致病性和傳播性分析
2.5 小結 第三章 H9N2亞型AIV感染影響vNDV對SPF雞的致病性
3.1 引言
3.2 實驗材料
    3.2.1 毒株
    3.2.2 雞胚及實驗動物
    3.2.3 主要分子生物學試劑
    3.2.4 主要儀器
    3.2.5 主要分子生物學軟件
3.3 實驗方法
    3.3.1 病毒EID₅₀的測定
    3.3.2 rGM株LD₅₀的測定
    3.3.3 實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)
    3.3.4 H9N2亞型AIV與vNDV的共感染SPF雞試驗
    3.3.5 肺臟病理切片的制備
    3.3.6 組織中NDV滴度檢測
    3.3.7 NDV排毒情況的檢測
    3.3.8 HI試驗
3.4 結果與分析
    3.4.1 病毒EID₅₀及LD₅₀的測定
    3.4.2 感染組臨床癥狀和存活狀況的統(tǒng)計
    3.4.3 病理損傷觀察
    3.4.4 攻毒組中NDV組織分布情況
    3.4.5 NDV排毒檢測
    3.4.6 NDV的HI抗體
3.5 小結 第四章 H9N2亞型AIV與vNDV共感染SPF雞肺臟轉錄組學的研究
4.1 引言
4.2 實驗材料
    4.2.1 毒株和實驗動物
    4.2.2 主要試劑
    4.2.3 主要儀器
    4.2.4 主要軟件
4.3 實驗方法
    4.3.1 病毒感染及肺臟的采集
    4.3.2 肺臟總RNA的提取
    4.3.3 文庫構建及轉錄組測序(RNA-seq)
    4.3.4 測序評估
    4.3.5 比對統(tǒng)計
    4.3.6 基因統(tǒng)計分析
    4.3.7 DEGs的Heatmap分析
    4.3.8 KEGG Pathway分析
    4.3.9 GO顯著性富集分析
    4.3.10 qRT-PCR驗證轉錄組結果
4.4 結果與分析
    4.4.1 樣本的重復性檢測
    4.4.2 基因表達數的統(tǒng)計
    4.4.3 DEGs的GO分析
    4.4.4 DEGs的KEGG Pathway分析
    4.4.5 宿主抗病毒反應DEGs的聚類分析
    4.4.6 qRT-PCR驗證RNA-Seq結果
4.5 小結 第五章 雞SOCS3蛋白在NDV復制過程中的作用研究
5.1 引言
5.2 實驗材料
    5.2.1 病毒與細胞
    5.2.2 感受態(tài)細胞和載體
    5.2.3 雞胚與實驗動物
    5.2.4 主要試劑
    5.2.5 主要試劑配方
    5.2.6 主要儀器
5.3 實驗方法
    5.3.1 引物設計
    5.3.2 雞SOCS3基因的組織分布
    5.3.3 蛋白免疫印跡(Western blot)動態(tài)分析NDV體外感染對SOCS3蛋白表達的影響
    5.3.4 雞SOCS3基因真核表達質粒的構建及蛋白表達
    
5.3.4.1 雞SOCS3基因真核表達質粒的構建
    
5.3.4.2 轉染
    
5.3.4.3 重組雞SOCS3蛋白過表達的鑒定
    5.3.5 體外過表達雞SOCS3蛋白對NDV復制的影響
    5.3.6 siRNA干擾DF-1 細胞中SOCS3基因的表達對NDV復制的影響
    5.3.7 BAY11-7082 對NDV誘導SOCS3蛋白表達的影響
    5.3.8 數據處理與分析
5.4 結果與分析
    5.4.1 雞SOCS3蛋白介導NDV感染過程中的蛋白互作網絡
    5.4.2 雞SOCS3基因的組織分布
    5.4.3 NDV體外感染可誘導雞SOCS3蛋白的表達
    5.4.4 雞SOCS3基因的真核表達
    
5.4.4.1 攜帶雞SOCS3基因的真核表達質粒序列測定結果分析
    
5.4.4.2 熒光顯微鏡下觀察真核表達產物
    
5.4.4.3 重組SOCS3蛋白的Western blot鑒定
    5.4.5 過表達雞SOCS3蛋白對NDV增殖的影響
    5.4.6 siRNA干擾SOCS3基因表達影響NDV在DF-1 細胞上增殖
    5.4.7 干擾DF-1細胞中的SOCS3基因表達可促進干擾素刺激因子的表達
    5.4.8 NDV感染可通過NF-κB信號通路調控SOCS3蛋白的表達
5.5 小結 第六章 全文討論和總結
6.1 全文討論
    6.1.1 AIV與NDV在廣東省流行病學的分析
    6.1.2 H9N2亞型AIV感染影響v NDV對SPF雞的致病性
    6.1.3 H9N2亞型AIV與NDV共感染SPF雞的肺臟轉錄組學的分析
    6.1.4 SOCS3蛋白介導NDV復制過程
6.2 全文總結 致謝 參考文獻 附錄A：攻讀博士期間發(fā)表文章 附錄B：參加的學術會議



本文編號：3914068