桑樹(Morus alba)根系發(fā)達,枝繁葉茂,生命力旺盛,具有較強的環(huán)境適應(yīng)性,因此在世界范圍內(nèi)分布廣泛。在我國,桑樹作為生態(tài)防護林選用樹種,可起到防沙固土,減少地表徑流,保持原生態(tài)土壤結(jié)構(gòu)的作用。另一方面,因桑樹生長迅速,地上部分生物量大,被應(yīng)用到自然生態(tài)修復(fù)系統(tǒng)中,例如修復(fù)被重金屬污染的土壤、多石的貧瘠荒漠以及戈壁沙漠化區(qū)域等。桑樹具有頑強的生存能力,源于其所擁有的獨特生理特性,近年來在植物遺傳學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域備受關(guān)注,涉及桑樹抗逆基因資源挖掘及開發(fā)利用等研究。本研究從桑樹中克隆得到3個干旱差異表達基因:葉綠體干旱脅迫誘導(dǎo)蛋白編碼基因(chloroplast drought-induced stress protein of 32 k Da,Ma CDSP32),IAA-氨基酸水解酶編碼基因(ILR1-5(IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 5,Ma ILR1)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,Ma APX2))進行基因克隆、表達分析及基因功能分析,通過對目標(biāo)序列的生物信息學(xué)分析、表達特性分析、轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性分析以及在...

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 干旱對植物生長的影響
    1.2 植物抗旱性的研究進展
        1.2.1 植物的抗旱性與旱后復(fù)水恢復(fù)生長的調(diào)節(jié)機制
        1.2.2 植物的抗旱性評價體系及提高植物抗逆性的需求和措施
    1.3 植物非生物脅迫下的氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)
        1.3.1 非生物脅迫對植物氧化還原系統(tǒng)的影響
        1.3.2 非生物脅迫下植物細胞中ROS的產(chǎn)生和代謝
    1.4 植物硫氧還蛋白家族(Trxs)及其廣泛作用
        1.4.1 Trxs功能概況
        1.4.2 葉綠體中的Trxs系統(tǒng)
        1.4.3 葉綠體中一種類硫氧還蛋白-CDSP32
    1.5 植物胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶(APX)研究進展
    1.6 植物生長素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究進展
    1.7 參與植物抗逆性幾種脅迫應(yīng)答因子的研究進展
        1.7.1 脯氨酸參與抗逆性的研究進展
        1.7.2 甜菜堿參與抗逆性的研究進展
        1.7.3 可溶性糖類參與抗逆性的研究進展
        1.7.4 脫落酸(ABA)參與抗逆性的研究進展
        1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)參與抗逆性的研究進展
    1.8 桑樹抗逆性及資源應(yīng)用研究進展
        1.8.1 古老的桑樹物種及其生存能力
        1.8.2 桑樹資源應(yīng)用發(fā)展現(xiàn)狀
        1.8.3 桑樹抗旱性分子機制研究進展
    1.9 本研究前期工作基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)
        1.9.1 前期工作基礎(chǔ)
        1.9.2 技術(shù)流程
第二章 桑樹中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析
    2.1 引言
    2.2 試驗材料
        2.2.1 植物材料
        2.2.2 主要儀器設(shè)備
        2.2.3 主要試劑及菌株
    2.3 試驗方法
        2.3.1 桑樹葉片總RNA提取與鑒定
        2.3.2 桑樹葉片cDNA合成
        2.3.3 基因克隆
        2.3.4 序列的生物信息學(xué)分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 桑樹中三個基因編碼區(qū)克隆及測序
        2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息學(xué)分析
        2.4.3 編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析
        2.4.4 GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫預(yù)測目標(biāo)基因功能
    2.5 小結(jié)
第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表達模式分析及多克隆抗體制備
    3.1 引言
    3.2 試驗材料
        3.2.1 植物材料與脅迫處理
        3.2.2 主要試劑耗材及儀器
    3.3 試驗方法
        3.3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA
        3.3.2 基因定量引物設(shè)計
        3.3.3 實時熒光定量qRT-PCR
        3.3.4 葉片含水量測定
        3.3.5 脯氨酸含量測定
        3.3.6 原核表達載體的構(gòu)建
        3.3.7 多克隆抗體制備
        3.3.8 多克隆抗體效價檢測
        3.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 基因在桑樹地上部分組織的表達規(guī)律
        3.4.2 基因在不同桑樹品種中的表達規(guī)律
        3.4.3 基因在桑樹中的生物鐘節(jié)律表達規(guī)律
        3.4.4 鹽脅迫對基因表達水平的影響
        3.4.5 高溫脅迫對基因表達水平的影響
        3.4.6 水分脅迫對基因表達水平的影響
        3.4.7 施加外源ABA對基因表達水平的影響
        3.4.8 施加外源乙烯利對基因表達水平的影響
        3.4.9 施加外源水楊酸對基因表達水平的影響
        3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析
        3.4.11 基因表達與蛋白純化
        3.4.12 多克隆抗體效價檢測
    3.5 小結(jié)
第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬時表達分析
    4.1 引言
    4.2 試驗材料
    4.3 試驗方法
        4.3.1 植物表達載體構(gòu)建
        4.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        4.3.3 基因瞬時轉(zhuǎn)化桑葉的處理方式
        4.3.4 qRT-PCR檢測基因表達量
        4.3.5 葉片中H₂O₂和O2
-的含量測定
        4.3.6 轉(zhuǎn)化煙草的亞細胞定位分析
        4.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 基因瞬時轉(zhuǎn)化浸染后離體桑葉的狀態(tài)
        4.4.2 基因產(chǎn)物的亞細胞定位
        4.4.3 瞬時表達MaCDSP32 基因?qū)﹄x體桑葉持水能力的影響
        4.4.4 MaCDSP32 瞬時表達離體桑葉的自然失水情況
        4.4.5 NaCl脅迫下離體桑葉氣孔開度的變化
        4.4.6 PEG脅迫下離體桑葉氣孔開度的變化
        4.4.7 PEG處理下脅迫相關(guān)基因表達量的變化
        4.4.8 NaCl處理下脅迫相關(guān)基因表達量的變化
        4.4.9 基因產(chǎn)物的亞細胞定位確認(rèn)
    4.5 小結(jié)
第五章 桑樹MaCDSP32 轉(zhuǎn)化煙草的功能研究
    5.1 引言
    5.2 試驗材料
        5.2.1 植物材料和生長條件
        5.2.2 主要試劑和耗材
        5.2.3 主要儀器
    5.3 試驗方法
        5.3.1 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因煙草鑒定
        5.3.2 MaCDSP32 表達產(chǎn)物亞細胞定位
        5.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草非生物脅迫處理
        5.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)和幼苗生長處理
        5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿含量測定
        5.3.6 葉片中ROS的組織定位和含量測定
        5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性測定
        5.3.8 光合作用氣體交換參數(shù)測定
        5.3.9 葉綠色素含量測定
        5.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 CDSP32序列在桑樹和煙草中的同源性比對
        5.4.2 陽性轉(zhuǎn)基因煙草PCR鑒定
        5.4.3 MaCDSP32 表達產(chǎn)物的亞細胞定位
        5.4.4 MaCDSP32 對轉(zhuǎn)基因煙草抗逆性的影響
    5.5 小結(jié)
第六章 桑樹MaCDSP32 轉(zhuǎn)化擬南芥的功能研究
    6.1 引言
    6.2 試驗材料
        6.2.1 植物材料和生長條件
        6.2.2 主要試劑和耗材
        6.2.3 主要儀器
    6.3 試驗方法
        6.3.1 構(gòu)建MaCDSP32 過表達擬南芥植株
        6.3.2 突變體擬南芥T-DNA插入鑒定
        6.3.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子脅迫處理
        6.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株非生物脅迫處理
        6.3.5 生理生化指標(biāo)測定
        6.3.6 擬南芥葉片氣孔開度測量
        6.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    6.4 結(jié)果與分析
        6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析
        6.4.2 AtCDSP32 突變體擬南芥植株鑒定
        6.4.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系在非生物脅迫下的抗逆性分析
        6.4.4 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥氣孔開度的影響
        6.4.5 非生物脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥抗氧化物酶活性的影響
        6.4.6 非生物脅迫對擬南芥抗氧化物酶編碼基因表達量的影響
        6.4.7 滲透脅迫對擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響
        6.4.8 MaCDSP32 過表達擬南芥植株的早花現(xiàn)象
    6.5 小結(jié)
第七章 MaCDSP32 轉(zhuǎn)基因煙草干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
    7.1 引言
    7.2 試驗材料
        7.2.1 植物材料
        7.2.2 脅迫處理方式及取樣
    7.3 試驗方法
        7.3.1 樣品轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建
        7.3.2 上機測序
        7.3.3 信息分析流程
    7.4 結(jié)果與分析
        7.4.1 OE和WT煙草干旱樣品轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)總體分析
        7.4.2 OE和WT煙草干旱轉(zhuǎn)錄組樣品差異表達基因分析
        7.4.3 OE和WT煙草干旱轉(zhuǎn)錄組差異表達基因維恩圖
        7.4.4 OE和WT煙草干旱轉(zhuǎn)錄組差異表達基因聚類熱圖
        7.4.5 OE和WT煙草干旱差異表達基因GO富集分析
        7.4.6 OE和WT煙草復(fù)水差異表達基因KEGG通路分析
        7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑差異基因KEGG通路分析
        7.4.8 淀粉和糖代謝途徑差異基因KEGG通路分析
        7.4.9 油菜素類固醇代謝途徑差異基因KEGG通路分析
        7.4.10 植物激素信號傳導(dǎo)代謝途徑差異基因KEGG通路分析
        7.4.11 光合元件固碳作用代謝途徑差異基因KEGG通路分析
        7.4.12 硫代謝途徑差異基因KEGG通路分析
    7.5 干旱和復(fù)水相反生理參數(shù)涉及差異表達基因GO富集分析
    7.6 小結(jié)
第八章 結(jié)論
    8.1 本研究總結(jié)
    8.2 本研究創(chuàng)新點
    8.3 有待進一步研究的問題
參考文獻
附錄
致謝
個人簡歷



本文編號：3871248

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