防御素是哺乳動(dòng)物先天免疫的重要組成部分,近些年的研究發(fā)現(xiàn)防御素具有抗菌活性、促炎抗炎、適應(yīng)性免疫等多種生物學(xué)功能,既具有開(kāi)發(fā)成抗生素替代品的潛力,又可以作為提高抗病力的藥物靶點(diǎn)。2012年通過(guò)對(duì)豬的基因組比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)了豬βdefensin 114(PBD114),目前為止PBD114的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,生物學(xué)功能及其機(jī)制尚未有報(bào)道。因此本研究開(kāi)展五個(gè)試驗(yàn),首先克隆并分析了PBD114基因序列,比較了不同品種豬PBD114基因表達(dá)的差異,探索了PBD114的表達(dá)調(diào)控機(jī)制;在此基礎(chǔ)上,成功表達(dá)出PBD114蛋白,并以小鼠和IPEC-J2細(xì)胞為模型,研究了PBD114在緩解腸道屏障炎性損傷中的作用和機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:試驗(yàn)一PBD114基因的克隆、序列分析及其在不同品種豬間的差異表達(dá)藏豬是西藏和川西地區(qū)特有的豬種之一,與外種豬相比,具有耐粗飼和抗病力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)分別以藏豬和DLY豬的cDNA為模板,克隆了藏豬和DLY豬PBD114基因CDS序列,用DNAMAN比對(duì)分析,且分析了豬、人、大猩猩和瘤牛的βdefensin114的氨基酸序列。結(jié)果表明:藏豬和DLY豬的PBD114基因CDS區(qū)序...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
本文縮略語(yǔ)表(Abbreviations)
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 防御素概述
        1.1 防御素的種類(lèi)
        1.2 防御素的分布與表達(dá)
    2 防御素的表達(dá)調(diào)控
        2.1 營(yíng)養(yǎng)素對(duì)豬防御素的表達(dá)調(diào)控
        2.2 非營(yíng)養(yǎng)素對(duì)豬防御素的表達(dá)調(diào)控
    3 防御素的生物學(xué)功能
        3.1 抗菌活性
        3.2 促炎和抗炎
        3.3 屏障保護(hù)作用
        3.4 加強(qiáng)趨化作用
        3.5 Defensins和 TLRs
        3.6 增強(qiáng)胞內(nèi)外殺傷能力
        3.7 促進(jìn)細(xì)胞分化
    4 Defensins的應(yīng)用中遇到的問(wèn)題
    5 存在的問(wèn)題
第二章 本研究的目的、意義、主要內(nèi)容和技術(shù)路線(xiàn)
    1 研究的目的和意義
    2 研究?jī)?nèi)容
    3 技術(shù)路線(xiàn)
第三章 試驗(yàn)研究
    試驗(yàn)一 PBD114 基因的克隆、序列分析及其在不同品種豬間的差異表達(dá)
        一、Beta defensin114 的序列分析
            1 PBD114 克隆技術(shù)圖
            2 試驗(yàn)材料
            3 試驗(yàn)方法
                3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
                3.2 PBD114 基因的擴(kuò)增
                3.3 核酸電泳
                3.4 DNA純化
                3.5 DNA加 A
                3.6 DNA連接
                3.7 大腸桿菌感受態(tài)制備
                3.8 轉(zhuǎn)化與初篩
                3.9 測(cè)序與分析
            4 試驗(yàn)結(jié)果
                4.1 PBD114 的克隆及其序列分析
                4.2 不同物種beta defensin114 同源性
            5 討論
            6 小結(jié)
        二、不同品種豬PBD114 基因的差異表達(dá)
            1 材料與方法
                1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
                1.2 組織樣品采集
                1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法
                    1.3.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
                    1.3.2 引物設(shè)計(jì)
                    1.3.3 qRT-PCR
                1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
            2 試驗(yàn)結(jié)果
                2.1 PBD114 在藏豬和DLY豬組織中的表達(dá)豐度
                2.2 PBD114 在藏豬和DLY豬中的差異表達(dá)
            3 討論
            4 小結(jié)
    試驗(yàn)二 PBD114 基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
                1.2.1 E.Coli K88 攻毒對(duì)PBD114 基因表達(dá)的影響
                1.2.2 不同TLRs信號(hào)途徑對(duì)PBD114 基因表達(dá)的影響
                1.2.3 轉(zhuǎn)錄因子RELA、FOS和 JUN對(duì) PBD114 基因表達(dá)的調(diào)控
                1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子RELA和 FOS的抑制對(duì)IPEC-J2的PBD114 基因表達(dá)的影響
            1.3 試驗(yàn)方法
                1.3.1 腹瀉評(píng)分
                1.3.2 E.coli K88 的培養(yǎng)
                1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)
                1.3.4 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR
                1.3.5 酶聯(lián)免疫檢測(cè)細(xì)胞因子
                1.3.6 PBD114 啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合預(yù)測(cè)
                1.3.7 載體構(gòu)建
                1.3.8 轉(zhuǎn)染與熒光檢測(cè)
            1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
        2 試驗(yàn)結(jié)果
            2.1 免疫激活對(duì)PBD114 基因表達(dá)的影響
            2.2 不同TLRs信號(hào)途徑對(duì)PBD114 基因表達(dá)的調(diào)控
            2.3 轉(zhuǎn)錄因子RELA、FOS和 JUN對(duì) PBD114 基因表達(dá)的調(diào)控
            2.4 反向驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子RELA和 FOS對(duì) PBD114 表達(dá)的調(diào)控
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗(yàn)三 PBD114 的大腸桿菌異源表達(dá)及其生物學(xué)特性研究
        1 表達(dá)策略
        2 試驗(yàn)材料
        3 試驗(yàn)方法
            3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2 重組大腸桿菌構(gòu)建
            3.3 誘導(dǎo)表達(dá)
            3.4 SDS-PAGE鑒定
            3.5 蛋白質(zhì)質(zhì)譜
            3.6 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化
                3.6.1 誘導(dǎo)初始OD值的優(yōu)化
                3.6.2 誘導(dǎo)劑IPTG的優(yōu)化
                3.6.3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化
            3.7 重組蛋白的純化回收
            3.8 PBD114 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性的預(yù)測(cè)
            3.9 MIC
            3.10 溶血性
            3.11 細(xì)胞毒性
        4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
        5 試驗(yàn)結(jié)果
            5.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
            5.2 重組菌Origami B-pET32-PBD114 的構(gòu)建
            5.3 重組蛋白rPBD114 的表達(dá)
            5.4 表達(dá)條件的優(yōu)化
            5.5 重組蛋白rPBD114 的純化和蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定
            5.6 重組蛋白rPBD114 的空間結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性
            5.7 最小抑菌濃度
            5.8 溶血性
            5.9 細(xì)胞毒性
        6 討論
        7 小結(jié)
    試驗(yàn)四 重組PBD114 對(duì)腸道屏障炎性損傷的緩解及其機(jī)制
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
                1.2.1 重組蛋白rPBD114 處理IPEC-J2 濃度梯度
                1.2.2 重組蛋白rPBD114 處理IPEC-J2 時(shí)間梯度
                1.2.3 重組蛋白rPBD114 緩解IPEC-J2 腸道屏障炎性損傷
                1.2.4 重組蛋白rPBD114 緩解IPEC-J2 腸道屏障炎性損傷及其機(jī)制
            1.3 試驗(yàn)方法
                1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
                1.3.2 抑制劑安全劑量
                1.3.3 細(xì)胞增殖
                1.3.4 熒光定量PCR
                1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
                1.3.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子
                1.3.7 免疫熒光檢測(cè)ZO-1和claudin-1
                1.3.8 免疫印跡
            1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
        2 試驗(yàn)結(jié)果
            2.1 重組蛋白rPBD114 濃度梯度和時(shí)間梯度的優(yōu)化
                2.1.1 重組蛋白rPBD114 濃度梯度優(yōu)化
                2.1.2 重組蛋白rPBD114 時(shí)間梯度優(yōu)化
            2.2 重組蛋白rPBD114 緩解IPEC-J2 炎性損傷
                2.2.1 重組蛋白rPBD114對(duì)LPS處理IPEC-J2 細(xì)胞增殖的影響
                2.2.2 重組蛋白rPBD114對(duì)LPS處理IPEC-J2 細(xì)胞凋亡的影響
                2.2.3 重組蛋白rPBD114對(duì)LPS處理IPEC-J2 細(xì)胞凋亡基因的影響
                2.2.4 重組蛋白rPBD114對(duì)LPS處理IPEC-J2 細(xì)胞炎癥因子的影響
                2.2.5 重組蛋白rPBD114對(duì)LPS處理IPEC-J2 細(xì)胞緊密連接蛋白的影響
            2.3 重組蛋白rPBD114 緩解IPEC-J2 腸道屏障炎性損傷及其機(jī)制
                2.3.1 抑制劑濃度梯度篩選
                2.3.2 重組蛋白rPBD114 和抑制劑對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞增殖的影響
                2.3.3 重組蛋白rPBD114 和抑制劑對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞緊密連接蛋白的影響
                2.3.4 重組蛋白rPBD114 和抑制劑對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞炎癥因子的影響
                2.3.5 重組蛋白rPBD114 和抑制劑對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞凋亡的影響
                2.3.6 重組蛋白rPBD114 和抑制劑對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞凋亡基因和凋亡蛋白的影響
                2.3.7 重組蛋白rPBD114 和抑制劑對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞NF-κB/MAPK信號(hào)通路蛋白的影響
        3 討論
        4 小結(jié)
    試驗(yàn)五 重組蛋白rPBD114 對(duì)小鼠腸道屏障炎性損傷的緩解作用
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
            1.3 飼養(yǎng)管理
            1.4 樣品采集
            1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法
                1.5.1 生長(zhǎng)性能
                1.5.2 血液生化
                1.5.3 空腸粘膜凋亡
                1.5.4 腸道形態(tài)
                1.5.5 空腸免疫熒光
                1.5.6 熒光定量PCR
            1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
        2 試驗(yàn)結(jié)果
            2.1 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠生長(zhǎng)性能的影響
            2.2 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠臟器指數(shù)的影響
            2.3 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠血清二胺氧化酶和D-乳酸的影響
            2.4 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠血清生化的影響
            2.5 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠血清免疫球蛋白和補(bǔ)體的影響
            2.6 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠腸道形態(tài)的影響
            2.7 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠空腸緊密連接蛋白的影響
            2.8 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠空腸凋亡及相關(guān)基因的影響
            2.9 重組蛋白rPBD114對(duì)ICR小鼠炎癥的影響
        3 討論
        4 小結(jié)
第四章 總體討論、結(jié)論與展望
    1 總體討論
    2 主要結(jié)論
    3 創(chuàng)新點(diǎn)
    4 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3871166